Ablación neuronal dirigida mediante microscopía de dos fotones en un pez cebra Larava

Resumen

Fuente: Muto, A., et al. Ablación de una población neuronal mediante láser de dos fotones y su evaluación mediante imágenes de calcio y registro de comportamiento en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, Se demuestra un procedimiento de ablación con láser de dos fotones, que permite la destrucción selectiva de neuronas fluorescentes en larvas de pez cebra inmovilizadas con agarosa. Las imágenes de alta resolución antes y después del procedimiento confirman un daño neuronal eficiente, como se observa por la ausencia de fluorescencia.

Protocolo

1. ablación de una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio láser de dos fotones

1. Comienza configurando el acoplamiento de una línea Gal4 que etiqueta neuronas específicas a estudiar y UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Asegúrese de usar el fondo nacre para ambos padres de modo que se puedan obtener nacre se puedan obtener homocigotos.
   NOTA: Los homocigotos de nacre no contienen melanóforos en la superficie del cuerpo (Figura 1B). En el presente estudio se utiliza una línea Gal4 gSAIzGFFM119B (que marca el pretectum) y otra línea Gal4 hspGFFDMC76A (que marca el ILH (Lóbulo del hipotálamo).

2. Al día siguiente de la configuración del apareamiento, recoge los huevos de pez cebra y levántalos a la etapa larvaria, momento en el que las neuronas de interés emitirán reporteros fluorescentes.

3. Monte la larva de pez cebra en agarosa de bajo punto de fusión al 2% (Figura 1B).

1. Comience preparando una solución madre de agarosa al 2%: disuelva 2 g de polvo de agarosa de bajo punto de fusión en 100 mL de agua del sistema (i.e., el agua utilizada para mantener al pez cebra adulto en un sistema de circulación de agua) o agua E3, llevando el agua al punto de ebullición en un microondas, y mezclando vigorosamente.

   1. Calienta en el microondas el caldo de agarosa de bajo punto de fusión del 2% hasta que hierva. Vierta 3,5-4,0 mL de agarosa en la tapa de una placa de Petri de 6 cm. Espere hasta que la agarosa se enfríe para que esté tibia al tacto antes de continuar.

   2. A continuación, coloque una sola larva (no anestesiada en este paso) en la agarosa. Siga ajustando la posición y orientación de la larva para que quede erguida, utilizando una aguja de disección (Figura 1C), hasta que la agarosa se solidifique para asegurar el posicionamiento adecuado de la larva.
      NOTA: La larva continuará nadando mientras la agarosa se solidifica.

   3. Una vez que la larva esté posicionada, espere 5 minutos para que la agarosa se solidifique completamente.

   4. Vierta 5 mL de solución de tricaína (0.4% a una concentración de trabajo 1x) sobre la agarosa.
      NOTA: Para evitar movimientos de las larvas durante la ablación láser, las larvas deben mantenerse anestesiadas durante todo el procedimiento de ablación.

4. Ablate la larva usando la función de blanqueo en un sistema de microscopía láser de dos fotones.

1. Coloque la larva incrustada en agarosa bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones e inicie el sistema de microscopía.

2. Inicie el software de adquisición de imágenes y haga clic en el botón "On" en la pestaña "Láser" para encender el láser (Figura 1D). Espere a que el "Estado" del láser cambie de "Ocupado" a "Modo bloqueado".

3. En la pestaña "Canales", ajuste la longitud de onda del láser a 880 nm (potencia máxima: aproximadamente 2.300 mW) para la ablación de EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), o a 800 nm (potencia máxima: aproximadamente 2.600 mW) para la ablación de GCaMP.

4. Seleccione la lente del objetivo 20X moviendo manualmente el revólver de la lente. Haga clic en la pestaña "Localizar", haga clic en "GFP" (proteína fluorescente verde) para cambiar las vías ópticas y vea directamente la fluorescencia a ojo.

5. Ubica el cerebro de la larva de pez cebra en el centro de la vista; luego haz clic en la pestaña "Adquisición" para volver a la microscopía de dos fotones.

6. Como registro de la condición 'antes de la ablación', tome una imagen de pila z con la lente del objetivo 20X a una velocidad de escaneo rápida (para evitar daños por calor). Posteriormente se comparan las imágenes tomadas antes y después de los experimentos de ablación (Figura 2A). Para obtener una pila z, haga clic en "Pila Z" para seleccionar la opción pila z y expandir la pestaña. Establezca el límite inferior (haga clic en el botón "Establecer primero") después de enfocarse en el extremo ventral del cerebro de la larva, y establezca el límite superior (haga clic en el botón "Establecer último") después de enfocarse en la superficie más dorsal del cerebro. A continuación, haga clic en el botón "Iniciar experimento" para ejecutar la adquisición de imágenes de la pila z.

7. Seleccione la lente del objetivo 63X moviendo manualmente el revólver de la lente.

8. Haga clic en la pestaña "Localizar" para cambiar a la microscopía epifluorescente, localice las células a ablacionar en el centro de la vista por el ojo, luego haga clic en la pestaña "Adquisición" para volver a la microscopía de escaneo láser.

5. En la pestaña "Modo de Adquisición", establece el "Tamaño del Marco" en 256 x 256. Haga clic en "En vivo" y observe las neuronas de interés.

6. Comenzando desde el lado más dorsal, encuentre un plano focal en el que las células a ablacionar estén enfocadas.

7. Marque una pequeña área circular de aproximadamente un tercio del tamaño de la célula en diámetro en cada neurona como una región de interés (ROI) utilizando la función "Regiones".

8. Establece la velocidad de escaneo en 13,93 s/256 x 256 píxeles (134,42 μm x 134,42 μm), lo que corresponde a un tiempo de permanencia del láser de aproximadamente 200 μs/pixel, o 200 μs/0,5 μm. Además, establezca 4 repeticiones ('Ciclo de iteración: 4'). Como alternativa, optimice el número de iteraciones y la velocidad de escaneo para lograr una ablación suficiente.

9. Realice la función 'Bleaching' para la ablación, en combinación con la 'Serie temporal (2 ciclos)' para obtener imágenes de la muestra (antes y después de la ablación) y 'Regions' (para establecer los ROIs) o funciones equivalentes en el software utilizado(Figura 1D) .

10. Al comparar la primera imagen (antes de la ablación) y la segunda imagen (después de la ablación) en el ciclo de series temporales, asegúrese de que después del blanqueo, la fluorescencia en las células objetivo disminuya a la observada en el nivel de fondo (Figura 2B).

11. Si la fluorescencia sigue presente después de la ablación, aumente el número de iteraciones.

12. A continuación, mueve el plano focal ligeramente más profundo (i.e.e., hacia el lado ventral), y elija el siguiente plano focal donde aparezcan las células no ablacionadas.

13. Realiza la función de blanqueo. Repita estos pasos hasta que se hayan ablacionado todas las células de la estructura neuronal de interés.

14. Después de pasar por todos los planos focales que cubren las estructuras neuronales a ablacionar, compruebe si las células han abolido la fluorescencia. Si se encuentra que algunas células todavía son fluorescentes debido a una ablación insuficiente, vuelva a irradiarlas con láser como se describió anteriormente.

15. Si la larva necesita ser recuperada de la agarosa después de la irradiación láser, no intente forzarla fuera de la agarosa porque esto podría dañar a la larva. En su lugar, haga con cuidado pequeños cortes en la agarosa alrededor de la larva perpendicularmente a la superficie de su cuerpo. Luego, espere a que la larva salga nadando de la agarosa por sí sola cuando desaparezca el efecto del anestésico.

16. Proceda a la siguiente larva para la ablación o realice experimentos de control utilizando otra población de neuronas que no estén involucradas en el comportamiento bajo investigación.
    NOTA: Aquí, como control, las neuronas del bulbo olfativo en las larvas de UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B fueron ablacionadas con láser utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente (Figura 2A, derecha).

17. Espere varias horas o 1 día para la recuperación antes de proceder a la imagen de Ca o al registro de comportamiento. Durante este tiempo de recuperación, compruebe la salud de las larvas (i.e.<span style='font-family:Roboto;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>, natación espontánea normal, sin daño aparente por calor alrededor de la zona ablacionada, etc.) y elimine las larvas que muestren cualquier signo de mala salud.

Resultados

Materiales