Microscopía de dos fotones para la obtención de imágenes in vivo de la microvasculatura cerebral de ratón

Resumen

Source: Nishimura, C. y cols. Cuantificación de la arquitectura vascular cerebral mediante microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de neuroinflamación inducida por el VIH. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra la visualización in vivo de los capilares corticales en el cerebro del ratón utilizando microscopía de dos fotones. Describe los pasos para inyectar un tinte fluorescente en un ratón anestesiado con una ventana cortical de cráneo delgado, preparando la configuración para la obtención de imágenes y la adquisición de imágenes detalladas de las estructuras microvasculares del cerebro para su análisis.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inyección del tinte fluorescente

1. Pellizca la piel de un ratón anestesiado en la parte medial del muslo izquierdo con las pinzas #5. Tire suavemente de la piel hacia arriba y use unas tijeras para cortar y quitar la piel. Preparar colorante de rodamina emisor de rojo conjugado con dextrano (70 kDa) (10 mg/kg disueltos en solución salina).
2. Localiza la vena femoral. Con una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G conectada, extraiga una solución previamente preparada de un colorante fluorescente apropiado para la obtención de imágenes en la línea de 130 μl de la jeringa. Elimine todas las burbujas de aire introduciendo el tinte completamente en la jeringa y golpeando firmemente la pared de la jeringa.
   1. Doble la aguja de 30 G en un ángulo de aproximadamente 30 grados presionándola contra una superficie dura con el lado bisel hacia arriba. Llene la aguja con el tinte y deseche el exceso de líquido, dejando una muestra de 100 μl.
3. Inyecte lentamente la muestra de 100 μl de tinte en la vena femoral. Después de retirar la aguja, aplique una presión constante y suave en el lugar de la inyección para detener el sangrado. Deje que el tinte circule durante 5 minutos.
4. Cierre el muslo izquierdo cosiendo la piel con una sutura 4-0, luego voltee con cuidado el ratón sobre su estómago y colóquelo en el arnés de la placa de la cabeza del ratón.
   

2. In vivo Imágenes de dos fotones

1. Mover el aparato quirúrgico al microscopio de dos fotones, asegurándose de mantener niveles continuos de anestesia. Coloque una pequeña cantidad de solución salina al 0,9 % en el depósito de la placa principal y baje el objetivo del microscopio para que entre en contacto con la solución salina. Localice el área de interés utilizando el objetivo de visualización de campo claro.
2. Ajuste la excitación del láser de dos fotones a una longitud de onda apropiada para el tinte fluorescente. Comience la obtención de imágenes de dos fotones con el objetivo 25x.
   Nótese que en estos experimentos, utilizamos un dextrano conjugado con un colorante de rodamina emisor de rojo que se excitó a una longitud de onda de 780 nm. Se utilizó un filtro de emisión de paso de banda 607/36 para detectar la fluorescencia del colorante, y un filtro de emisión de paso de banda 480/20 para detectar la autofluorescencia arterial.
3. Localice un lecho capilar en la pantalla de visualización y amplíe esta área con el zoom óptico 2. Adquiera imágenes de los capilares utilizando el software de imágenes de dos fotones.

Materiales