Imágenes de fluorescencia de la agregación de proteínas PolyQ en neuronas de Caenorhabditis elegans

Resumen

Fuente: Pigazzini, M. L., et. al. Caracterización de estructuras amiloides en el envejecimiento C. elegans utilizando imágenes de fluorescencia de por vida. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra el uso de la microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM) para evaluar la agregación de proteínas polyQ en neuronas C. elegans, comparando gusanos de control y deficientes en proteínas chaperonas. El aumento de la agregación en gusanos deficientes en chaperonas promueve la transferencia de energía entre fluoróforos agrupados, lo que reduce la vida útil de la fluorescencia. Los mapas codificados por colores generados por FLIM representan estas diferencias, destacando los niveles de agregación entre los grupos experimentales.

Protocolo

1. Adquisición de datos FLIM

NOTA: En este protocolo, la vida útil del fluoróforo se adquiere mediante el método TCSPC en el dominio del tiempo. FLIM requiere que el láser genere un pulso de luz a una velocidad de repetición establecida y constante. La tasa de repetición varía según el tipo de láser y debe ser conocida por el usuario. Las mediciones de la vida útil se logran mediante detectores y equipos electrónicos instalados junto con un microscopio convencional. En este protocolo, las mediciones se realizan en tres microscopios confocales de barrido láser diferentes con detectores y software proporcionados por dos empresas diferentes (Tabla de materiales) para la adquisición de las vidas útil de mRFP, CFP e YFP, respectivamente. Compruebe que los filtros correctos de emisión/excitación estén en su lugar y minimice cualquier luz de fondo o del monitor antes de comenzar. Antes de comenzar cualquier experimento, establezca la fotoestabilidad del fluoróforo elegido. Si el fluoróforo se blanquea en poco tiempo dentro de los tejidos del nematodo, no es adecuado para las mediciones de FLIM en C. elegans.

1. Abra el software de adquisición FLIM. El software FLIM también permite el control del microscopio confocal. Localice la pestaña/botón para permitir que se habiliten las salidas del detector y presione Enable Outputs.
2. Adquiera la función de respuesta del instrumento (IRF), que describe la precisión de la temporización de la configuración del instrumento.
   NOTA: Este paso debe realizarse preferiblemente antes de montar los nematodos.
   1. Si están disponibles, retire los filtros de excitación/emisión.
   2. Coloque un cubreobjetos vacío sobre el objetivo y encuentre su superficie. Registre la señal de dispersión obtenida del cubreobjetos durante un mínimo de 30 s.
      NOTA: Para una vida útil de varios nanosegundos, el software de adquisición puede estimar automáticamente el cambio de IRF. Siempre se recomienda adquirir un IRF.
3. Coloque la diapositiva con el C. elegans en el escenario. Usando una lente de aumento de 10x en modo de transmisión y localice la posición de los nematodos en el portaobjetos.
4. Retire la diapositiva, cambie el objetivo a una lente de aumento de 63x y aplique el medio de inmersión requerido (por ejemplo, aceite). Vuelva a colocar el portaobjetos en la plataforma y localice los nematodos.
5. Localice el Pinhole Manager en el software de adquisición y ábralo en el Maximum. Comience a escanear la muestra, seleccione una región de interés (por ejemplo, cabeza, parte superior del cuerpo) y concéntrese en su plano de proyección máximo.
6. Controle la frecuencia del pulso láser y los otros tres valores presentes en la interfaz del software: el Discriminador de fracción constante (CFD), el Time-to-Amplitude (TAC), y el Convertidor analógico a digital (ADC).
   NOTA: El láser debe tener una puerta máxima de 1 x 10⁸ recuentos de fotones individuales. Este número representa el número máximo de fotones suministrados por el láser. El CFD proporciona información sobre la recepción del pulso de fotón único en referencia al pulso láser por parte del detector. Este valor debe ser aproximadamente 1 x 10⁵. El TAC discrimina entre el momento en que se detectó un fotón y el siguiente pulso láser. Finalmente, el ADC convierte el voltaje TAC en una señal de memoria almacenable. El CFD, el TAC y el ADC deben tener valores similares para garantizar que los fotones emitidos por el fluoróforo no se pierdan. La evaluación correcta de estos parámetros garantiza que se recolecten suficientes fotones para crear un mapa de vida útil preciso.
7. En la interfaz del software FLIM, obtenga una vista previa del número de fotones detectados: el valor de ADC debe estar entre 1 x 10⁴ y 1 x 10⁵. Si es necesario, cambie el enfoque a un plano diferente o aumente la potencia del láser para recolectar más fotones.
   NOTA: En general, el número de fotones registrados por segundo no debe exceder el 1% de la tasa de repetición del láser.
8. En la barra de menús, seleccione la pestaña para establecer los parámetros de adquisición. Seleccione scan sync in para permitir la detección de un solo fotón.
9. Establezca la adquisición en una cantidad fija de tiempo o un número fijo de fotones. Por ejemplo, adquiera una curva de decaimiento de vida útil durante 2 minutos o hasta que un solo píxel alcance un recuento de fotones de 2.000 eventos individuales. Presione Start para comenzar la adquisición.
   NOTA: Diferentes fluoróforos requerirán diferentes láseres y filtros de excitación y emisión. De acuerdo con el brillo de la muestra, la potencia del láser también se puede ajustar, lo que no interferirá con la vida útil. Estos protocolos utilizan los siguientes ajustes de excitación/emisión: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Se empleó un láser pulsado de dos fotones para las mediciones de CFP utilizando ex800/em440 nm. La cantidad de tiempo y el recuento de fotones necesarios para la adquisición de un mapa FLIM deberán establecerse empíricamente para cada configuración y cada propósito experimental.

2. Análisis de datos FLIM utilizando el software FLIMfit

NOTA: Realice análisis de datos utilizando la herramienta de software FLIMfit desarrollada en el Imperial College de Londres (véase Figura 1).

1. Abra el software e importe los archivos de datos FLIM a través de Archivo | Cargar datos FLIM. Cargue todas las muestras de una condición, incluso si se obtuvieron en diferentes sesiones y de diferentes repeticiones biológicas.
2. Si es necesario, segmente un solo nematodo de cualquier imagen FLIM a través de Segmentación | Gerente de segmentación. Arrastre la herramienta de recorte alrededor del área de interés hasta que se resalte. Una vez completado, presione OK.
   NOTA: Se debe realizar la segmentación para todas las imágenes.
3. Seleccione una región pequeña donde aparezca la imagen basada en la intensidad de un C. elegans (Figura 1, Flechas 1). La curva de decaimiento de esa región aparecerá en la gran ventana de decaimiento en el lado derecho de la interfaz (Figura 1, Flecha 2).
   NOTA: El decaimiento se puede mostrar lineal o logarítmicamente.
4. Establezca los parámetros correctos para extrapolar la vida útil a través del algoritmo del software, como se describe en los pasos 2.5-2.8.
5. En la pestaña Data (Figura 1, flecha 3):
   1. Establezca un valor arbitrario Mínimo integrado para excluir cualquier píxel que sea demasiado tenue para producir un Buen ajuste. Dependiendo de la muestra de C. elegans, este valor varía de 40 a 300. Introduzca diferentes valores hasta que se logre una vista previa satisfactoria.
   2. Seleccione un número Time Min y un número Time Max para limitar la señal FLIM a estos valores. Se excluirán todos los eventos que aparezcan antes y después de este umbral.
      NOTA: Por ejemplo, para el análisis de mRFP, se excluyeron los eventos anteriores a 800 ps y después de 4.000 ps. Estos valores dependen de la vida útil del fluoróforo y deben ser determinados por el usuario final.
   3. No cambie el ajuste preestablecido Counts/Photon de 1.
   4. Introduzca la tasa de repetición Tasa de repetición, en MHz, del láser utilizado durante la adquisición.
      NOTA: Para el protocolo actual, se utilizaron diferentes láseres con varias tasas de repetición. El láser de dos fotones utilizado para la adquisición de la vida útil de CFP posee una tasa de repetición de 80 MHz, para YFP el láser repite a 40 MHz y para mRFP el valor es de 78,01 MHz. Estos valores se introdujeron en FLIMfit de acuerdo con la muestra analizada.
   5. Introduzca un valor Gate Max para excluir todos los píxeles saturados.
      NOTA: Para las mediciones de vida útil en C. elegans, este valor se establece en cualquier número grande (por ejemplo, 1 x 10⁸).
6. En la pestaña Lifetime, seleccione un ajuste global que se utilizará (por ejemplo, un ajuste por píxeles). Véase Figura 1, flecha 4.
   NOTA: A Pixel-wise ajustarse a un decaimiento ajustado a cada píxel individual. Un ajuste En cuanto a la imagen producirá un ajuste global de cada imagen individual y mostrará un único valor de vida útil por imagen. Un ajuste Global-wise producirá un solo ajuste en todo el conjunto de datos. Se proporciona un único valor de vida útil para todas las imágenes.
7. No cambie ningún otro parámetro excepto el No. Exp si se sabe que el decaimiento de fluorescencia elegido es multiexponencial y exhibe más de un tiempo de vida.
   NOTA: En el presente protocolo, esta función se utilizó para calcular la vida útil del fluoróforo CFP biexponencial.
8. Cargue el IRF a través del menú IRF: IRF | Cargar IRF. Para estimar el desplazamiento de IRF, seleccione IRF | Estimación del cambio de IRF. Un conjunto de valores aparecerá automáticamente en la pestaña IRF. Una vez establecido esto, no cambie ningún otro parámetro de esta pestaña.
9. Una vez que todos los parámetros estén establecidos, presione Fit Dataset (Figura 1, Flecha 5). El algoritmo producirá un ajuste para la curva de decaimiento y establecerá un valor de vida útil para cada imagen.
   NOTA: El ajuste resultante, resaltado en una línea azul, debe superponerse con todos los eventos. Un buen ajuste se obtiene cuando todos los eventos están alineados a lo largo del ajuste.
10. Haga clic en la pestaña Parámetros (Figura 1, Flecha 6), ubicada dentro de los menús superiores derechos de la interfaz del software, y seleccione {TAG_591}}Estadística: w_mean (media ponderada) y compruebe que el chi2{{ TAG_598}} el valor es lo más cercano posible a 1.
    NOTA: A chi2 cerca de uno asegura la precisión del ajuste. Por lo tanto, el valor de vida útil de la imagen seleccionada se revela como tau_1.
11. Exporta cualquier información de interés: Archivo | Exportar imágenes de intensidad/Tabla de resultados de ajuste/Imágenes/Histogramas. Guarde la configuración de datos utilizada para calcular la vida útil: Archivo | Guardar configuración de datos.
    NOTA: Los parámetros empleados se guardarán para futuros análisis de las muestras seleccionadas.

3. Representaciones gráficas de los datos FLIM

NOTA: Las vidas recogidas de diferentes muestras se pueden representar visualmente de varias maneras. Seleccione esta opción para indicar los valores de duración en nanosegundos o picosegundos.

1. Muestre la calidad del ajuste y la precisión de la curva exportando la curva de decaimiento directamente desde FLIMfit.
2. Represente la distribución de los fotones trazando la frecuencia del recuento de fotones frente al valor de vida útil en un histograma.
3. Por último, para la comparación estadística, si se comparan dos o más muestras, coloque los valores de vida útil más la desviación estándar de la media en un gráfico de barras de dispersión. Realice cualquier análisis estadístico que desee.

Resultados

Materiales