Visualización de un trombo cerebral en un ratón mediante imágenes de microtomografía computarizada

Abstract

Fuente: Kim, D., et. al. Combinación de imágenes fluorescentes de infrarrojo cercano y tomografía microcomputarizada para la visualización directa de tromboembolios cerebrales. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la visualización de trombos cerebrales en ratones utilizando imágenes de microtomografía computarizada (micro-CT). A un modelo de ratón con trombo cerebral se le inyectan nanopartículas de oro dirigidas a la fibrina que actúan como agente de contraste. El ratón se coloca en la cama de una máquina de micro-TC y las imágenes se adquieren desde múltiples ángulos. Utilizando el software adecuado, las imágenes se reconstruyen y procesan.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de un coágulo formado exógenamente marcado con marcador de fluorescencia (Figura 1)

1. Anestesiar un ratón en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 3% mezclado con oxígeno al 30% (1,5 L/min 100% de oxígeno). Asegure la profundidad adecuada de la anestesia observando el tono muscular y confirmando la ausencia del reflejo de pinzamiento del dedo del pie.
2. Coloque al animal en una cortina estéril en posición prona y manténgalo bajo anestesia con una máscara de inhalación e isoflurano al 2% mezclado con oxígeno al 30%. Realice los siguientes procedimientos utilizando técnicas asépticas y batas/mascarillas/guantes/instrumentos estériles. Mantener las condiciones estériles limpiando y desinfectando el área experimental con alcohol al 70% antes y después de los procedimientos.
3. Recoja alrededor de 300 ~ 1,000 μl de sangre arterial después de la punción cardíaca. Mezcle 70 μl de sangre total con 30 μl de sonda C15 (concentración de 20 μmol/L), una sonda fluorescente Cy5.5 sensible a la actividad de reticulación de fibrina de la enzima de coagulación del factor XIII activado (FXIIIa), para marcar fluorescentemente el coágulo (Figura 1A). Inyecte la sangre mezclada con una jeringa de 3 ml (aguja de calibre 23) en un tubo de polietileno de 20 cm de largo (PE-50, diámetro interno de 0,58 mm). Los tubos de PE deben estar esterilizados (o certificados como estériles por el fabricante) y los coágulos deben prepararse asépticamente en una campana de cultivo de tejidos.
4. Verifica la muerte del animal observando la falta de respiración y pulso cardíaco.
5. Deje el tubo cargado de sangre a temperatura ambiente durante 2 horas, luego a 4 °C durante 22 horas, y realice los siguientes procedimientos, como se informó anteriormente.
6. Corta el tubo que contiene el trombo en trozos de 1,5 cm de largo. Usando una jeringa de 3 ml llena de solución salina tamponada con fosfato (PBS), expulse el trombo a una placa de 6 pocillos que contenga PBS inyectando PBS suavemente en cada pieza de tubo. Lavar los trombos tres veces con PBS (Figura 1B).
7. Cargue la porción del extremo distal de un tubo de PE-10 de 15 cm de largo (diámetro interno de 0,28 mm) con un trombo de 1,5 cm de largo estirando cuidadosamente el trombo lavado, evitando las burbujas de aire, utilizando una jeringa de 1 ml llena de solución salina con una aguja de calibre 30 que se inserta en el extremo proximal del tubo.
8. Conecte el tubo de PE-10 cargado de trombo con un tubo de PE-50 de 3 cm de largo (diámetro interno de 0,58 mm) modificado para tener un extremo cónico (diámetro interno de 200 μm), que se colocará en el área de bifurcación de la arteria cerebral media (ACM) y la arteria cerebral anterior (ACA) de la arteria carótida interna (ICA) en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular embólico (Figura 1C).

2. Modelado de un modelo de ratón de accidente cerebrovascular tromboembólico (Figura 2)

1. Anestesiar a un ratón diferente para acariciarlo en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 3% mezclado con oxígeno al 30% (1,5 L/min). Inyectar meloxicam (5 mg/kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor postquirúrgico. Asegure la profundidad adecuada de la anestesia observando el tono muscular y confirmando la ausencia del reflejo de pinzamiento del dedo del pie.
2. Aplique una pequeña cantidad de ungüento veterinario en cada ojo para evitar la sequedad durante la anestesia. Realizar los siguientes procedimientos quirúrgicos utilizando técnicas asépticas y batas/mascarillas/guantes/instrumentos estériles. Mantener las condiciones estériles limpiando y desinfectando el área quirúrgica con alcohol al 70% antes, durante y después de la cirugía.
3. Mueva el ratón a una mesa de operaciones. Coloque al animal en una cortina estéril en posición prona y manténgalo bajo anestesia con una máscara de inhalación e isoflurano al 2%. A continuación, fije la temperatura corporal a 36,5 °C con una manta homeotérmica con retroalimentación de un termómetro rectal.
4. Después de la preparación quirúrgica con betadine y alcohol al 70%, realice una incisión vertical de 1 cm utilizando un bisturí en el cuero cabelludo entre la oreja izquierda y el ojo. Pegue el extremo distal de la fibra óptica de un caudalímetro láser Doppler sobre la superficie expuesta del hueso temporal izquierdo (1 mm a la izquierda y 4 mm por debajo del bregma). Luego, inicie el monitoreo de flujo Doppler (Figura 2A).
5. Acueste al animal. Endereza el cuello tirando del diente frontal superior con una cuerda atada a un alfiler y afeita la zona del cuello. Luego, haga una incisión vertical de 3 cm en la línea media, extiéndala y exponga el área del bulbo carotídeo izquierdo mediante la disección de los tejidos blandos perivasculares. Tenga cuidado de no lesionar el nervio vago.
6. Ligar la arteria carótida común proximal izquierda (ACC) con una sutura estéril de seda negra 6-0, y ligar la ACI izquierda y la arteria pterigopalatina izquierda (PPA) con suturas estériles de seda negra 7-0.
7. Cauterizar la arteria tiroidea superior izquierda, que es una rama de la arteria carótida externa izquierda, mediante una cauterización eléctrica monopolar, y ligar la arteria carótida externa (ECA) proximal izquierda sin apretar y el sitio más distal firmemente con suturas estériles de seda negra 7-0.
8. Con una microtijera, haga un pequeño orificio (de aproximadamente 0,2 ~ 0,25 μm de diámetro) entre los sitios ligados del ECA.
9. Inserte el catéter que contiene el trombo en el orificio del ECA mientras afloja la ligadura proximal del ECA. Vuelva a apretar la ligadura proximal de ECA después de avanzar el catéter en el CCA para sujetar el catéter en su lugar.
10. Cauterizar para cortar la parte distal del ACE, que es distal al sitio de ligadura distal, y girar el ECA proximal libre en el sentido de las agujas del reloj para alinearlo en la dirección del ICA mientras se retira el catéter del CCA. Luego, avance el catéter unos 9 mm en el área de bifurcación MCA-ACA del ICA distal inmediatamente después de aflojar la ligadura de ICA. A continuación, apriete la ligadura ICA.
11. Coloque el trombo en el área de bifurcación presionando suavemente la jeringa 1 ml para inyectar el trombo. Comprobar la disminución del flujo sanguíneo cerebral Doppler (CBF), que debe reducirse en un 30% o menos respecto al valor basal, si el trombo ha logrado ocluir el vaso (Figura 2B).
12. Retire el catéter y lige el sitio proximal del ECA de forma inmediata y firme. Además, desligar el CCA y el PPA.
13. Cierre el sitio de la incisión con suturas de seda 6-0. Detenga la anestesia después de continuar con la monitorización Doppler durante el tiempo requerido (en este caso, durante 30 minutos después de la inyección del trombo). Regresa el ratón a una jaula vacía y mantenlo caliente con una lámpara de calentamiento. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.

3. Imagen microCT in vivo de trombo cerebral (Figura 3)

1. Vuelva a anestesiar al ratón con isoflurano al 2% como se describe en el paso 2.1 en un punto de tiempo preespecificado (aquí, 1 hora) después del inicio del accidente cerebrovascular embólico debido a la colocación del trombo en la arteria cerebral. Asegure la profundidad adecuada de la anestesia confirmando la ausencia del reflejo de pinzamiento del dedo del pie. Aplique una pequeña cantidad de ungüento veterinario en cada ojo para evitar la sequedad durante la anestesia.
2. Resuspenda las nanopartículas de oro dirigidas a la fibrina (fib-GC-AuNP4) a una concentración de 10 mg Au/ml en 10 mM de PBS, y sonique el agente de imagen del trombo durante 30 min para asegurar la disolución y dispersión de las nanopartículas. Inyectar 300 μl de fib-GC-AuNP (10 mg/ml) en la vena del pene.
3. Coloque al animal en la cama de una máquina de microtomografía computarizada y enderece el cuello tirando del diente frontal superior con una cuerda unida a un alfiler para reducir los artefactos de movimiento.
4. A los 5 minutos después de la inyección de fib-GC-AuNP, comience a obtener imágenes de micro-TC del cerebro. Para los experimentos descritos aquí, utilice los siguientes parámetros de imagen: 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm³ de campo de visión, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm³ de tamaño de vóxel, 100 milisegundos por fotograma, un promedio, 360 vistas, matriz de reconstrucción de 512 x 512, 600 cortes, tiempo de escaneo de 64 segundos.
5. Regresa el ratón a una jaula vacía y mantenlo caliente con una lámpara de calentamiento. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
6. Transforme los datos de imagen en bruto en formato DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) utilizando el comando "Inicio" del panel "Reconstrucción" en un paquete de software instalado en el escáner de micro-CT.
7. Para los análisis cuantitativos de las imágenes (en el paso 6), transforme los datos DICOM a formato TIFF utilizando un paquete de software disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
8. Para análisis cualitativos, así como análisis cuantitativos de una manera más sencilla y rápida, utilice el paquete de software y las imágenes originales de 0,054 mm de espesor en formato DICOM para generar un nuevo conjunto de imágenes axiales y coronales renderizadas con un grosor de 1 o 2 mm (en este caso, 2 mm), como se indica a continuación.
   1. Seleccione la carpeta DICOM en el árbol 'Fuente de datos', haga clic con el botón derecho del ratón e importe la carpeta a 'MasterDB' o 'PrivateDB'.
   2. Haga clic en 'MasterDB' o 'PrivateDB' en el árbol 'Fuente de datos' y seleccione la carpeta importada. Después de hacer clic en la pestaña '3D' en el panel más a la izquierda, cuando aparezca la ventana 'Opciones de carga', presione 'OK' para importar una secuencia de imágenes en la carpeta como una pila.
   3. Cambie la representación de la imagen al formato de proyección de máxima intensidad (MIP) haciendo clic en la palabra 'MRP' en las ventanas de imagen axial y coronal y seleccionando 'MIP' en el menú emergente. Luego, cambie el grosor de la imagen a 2 mm después de hacer clic en 'TH : 0 [mm]' en la misma ventana.
   4. Utilizando la barra de navegación 3D de 2 mm de ancho que permite explorar una pila de imágenes y cortarla en un ángulo y ubicación adecuados, prepare una imagen de sección axial de 2 mm de espesor con cobertura total del círculo de Willis (COW), que alberga trombos. Haga clic en el botón de captura (icono de la cámara) en el panel 'Salida'. Guarde la imagen en formato TIFF.
9. A continuación, prepare cinco imágenes de la sección coronal de 2 mm de grosor que cubran de forma contigua desde el lóbulo frontal hasta el cerebelo.
   1. En primer lugar, prepare el segundo corte alineando cuidadosamente la barra del navegador en la imagen axial para que la imagen coronal pueda visualizar mejor los trombos MCA-ACA.

A continuación, prepara las otras cuatro rodajas de forma contigua. Haga clic en el botón de captura (icono de la cámara) en el panel 'Salida'. Guarde las imágenes en formato TIFF.

Results

Figura 1: Descripción general de la preparación de coágulos de sangre marcados con fluorescencia. (A) Mezcla de sangre entera fresca con sonda fluorescente de infrarrojo cercano (NIRF) Cy5.5 (C15) que está unida covalentemente a las hebras d...

Materials