Microscopía de dos fotones para monitorizar la dinámica del calcio en los fotorreceptores de los conos de la retina de los ratones

Resumen

Fuente: Kulkarni, M. et al. Imágenes de la dinámica de Ca²⁺ en los terminales de los axones fotorreceptores de cono de la retina del ratón. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra el uso de la microscopía de dos fotones para monitorear la dinámica del calcio en los fotorreceptores de cono de la retina de un ratón transgénico. Describe los pasos para preparar cortes de retina, obtener imágenes de biosensores de calcio basados en FRET y analizar los cambios de fluorescencia para cuantificar los niveles de calcio bajo iluminación de fondo y estimulación lumínica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación de cortes (10 - 15 min)
   1. Prepare de antemano las membranas de filtro de nitrocelulosa para el corte de retina y los cubreobjetos de vidrio para montar los cortes y transferirlos a la cámara de registro. Corte la membrana del filtro de nitrocelulosa en trozos rectangulares de aproximadamente 10 x 5 mm con unas tijeras. Corte los cubreobjetos en piezas rectangulares de aproximadamente 10 x 5 mm con un cortador de vidrio.
   2. Sumerja lentamente un portaobjetos de vidrio en la solución extracelular cerca del tejido. Tire suavemente del corte de retina obtenido del ratón biosensor HR2.1:TN-XL Ca²⁺ sobre el portaobjetos de vidrio con la célula ganglionar hacia arriba agarrándola por el borde con un par de pinzas. Este proceso reduce el daño mecánico y el plegamiento del tejido.
   3. Elija la región de la retina que está relacionada con la pregunta de investigación respectiva. Corta una pieza rectangular de aproximadamente 1 x 2 mm de la región de la retina seleccionada con una hoja de bisturí curva. Limpie el exceso de solución alrededor del tejido.
   4. Coloque la membrana del filtro en la parte superior de la pieza de retina de manera que el lado de la célula ganglionar se adhiera a la membrana. Inmediatamente, agregue una gota de medio extracelular sobre la membrana para unir firmemente el tejido a la membrana.
   5. Transfiera el tejido de la retina montado en la membrana a la cámara de corte que contiene una solución extracelular fresca.
   6. Corte la retina en cortes verticales de 200 μm de grosor (Figura 1B) con una hoja de afeitar nueva conectada a un picador de tejidos. Cambie la cuchilla para cada pieza de retina.
      Nota: La hoja de afeitar debe estar perfectamente alineada con la superficie del fondo de la cámara de corte de manera que toda la membrana se parta simultáneamente, como lo indica un sonido de "clic" al cortar. De lo contrario, la cuchilla puede doblarse y dañar la rebanada.
   7. Pegue una sola rebanada montada en la membrana a un cubreobjetos de vidrio aplicando grasa de alto vacío solo en los extremos de la membrana (Figura 1C). Mantenga la superficie del vidrio debajo de la retina libre de grasa.
   8. Mantenga las rodajas montadas en cubreobjetos cubiertas por una gota de solución extracelular en la cámara de retención (un recipiente cerrado y resistente a la luz, por ejemplo, una placa de Petri con la tapa cubierta con papel de aluminio mmm) bajo una atmósfera de carboxigeno a temperatura ambiente (RT). Introduzca carboxigeno burbujeando un pequeño depósito de agua para mantener humidificada la atmósfera en la cámara de retención; Esto evita que las rodajas se sequen.
   9. Deje reposar los cortes en la cámara de retención durante 10 a 15 minutos antes de moverlos (uno por uno) a la cámara de registro. Las lonchas se pueden mantener hasta 4-5 horas en una cámara de retención a RT (~21 °C).

2. Microscopía de dos fotones Ca²⁺ Imaging

1. de dos fotones
   1. Utilice un microscopio de dos fotones de tipo microscopio de objetivo móvil (MOM).
      Nota: Se puede utilizar cualquier microscopio vertical de dos fotones que cumpla con los siguientes requisitos mínimos: Debe estar equipado con (a) un láser pulsado sintonizable a ~860 nm, (b) un mínimo de dos canales de fluorescencia adquiridos simultáneamente, (c) filtros para la proteína fluorescente cian mejorada (eCFP) y fluorescencia citrina, (d) un estimulador de luz, y (e) software que permite grabar secuencias de imágenes en lapso de tiempo a una velocidad de fotogramas suficiente para resolver las señales de interés de Ca²⁺.
   2. Inicie el sistema de imágenes de dos fotones según lo indicado por el fabricante. Siga estrictamente las pautas de seguridad del láser de la instalación. Encienda el láser y ajústelo a ~ 860 nm.
   3. Transfiera un corte de la cámara de retención a la cámara de registro e inmediatamente comience a perfundir con solución extracelular carboxeada. Mantener un caudal de perfusión de 2 ml/min y una temperatura de 37 °C en la cámara de registro.
   4. Utilice un objetivo de inmersión en agua de apertura numérica (NA) de 20X 0,95. Si está disponible, use una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) en combinación con un diodo emisor de luz infrarroja (LED) debajo de la cámara de grabación para ubicar el corte de retina (Figura 2). De lo contrario, localice el corte utilizando imágenes de dos fotones (ver 2.1.5).
   5. Cambie a imágenes de dos fotones para ver la expresión del biosensor. Encienda los dos canales de detección para imágenes de fluorescencia de eCFP y citrino.
   6. Utilice el software de adquisición de imágenes que controla el microscopio de dos fotones para escanear y seleccionar una fila de terminales de cono para el registro (Figura 3A). Establezca la adquisición de imágenes en imágenes de 128 x 16 píxeles (31,25 Hz) o una configuración similar. Restrinja el área escaneada a los terminales de cono para evitar el blanqueo de los fotopigmentos en los segmentos externos.
      Nota: Para el sensor de calcio TN-XL (τ = ~0,6 seg para la unión de Ca²⁺, τ = ~0,2 seg para la desvinculación de Ca²⁺), se recomienda una velocidad de fotogramas mínima de ~8 Hz.
   7. Estimulación de luz y grabación
      1. Utilice un estimulador de luz de campo completo de subetapa para realizar los siguientes pasos.
         Nota: Una solución simple para un estimulador de luz de campo completo es usar dos LED filtrados por paso de banda (por ejemplo, "azul": 360 paso de banda (BP) 12, "verde": 578 BP 10) que coincidan con las sensibilidades de longitud de onda de los conos de ratón pero que al mismo tiempo no coincidan con los filtros utilizados para la detección de fluorescencia. El condensador enfoca la luz de los LED a través de la parte inferior de la cámara de grabación (Figura 2).
      2. Encienda el láser y deje que los conos se adapten al láser de barrido y a la luz de fondo del estímulo (20 - 30 segundos) antes de presentar estímulos luminosos (ver 2.2.3) o aplicar agentes farmacológicos.
      3. Iniciar la presentación de estímulos arbitrarios (p. ej., destellos de luz, como se muestra en la Figura 3B, C). En el caso del estimulador descrito en el paso 2.2.1, genere los estímulos modulando la intensidad de los dos LED a lo largo del tiempo utilizando una placa de microprocesador controlada por un software personalizado.
      4. Comience a grabar los dos canales de fluorescencia (p. ej., a 483 nm para "azul"
   8. Transferencia de energía por resonancia (FRET) eCFP donante de Förster y a 535 nm para el aceptor FRET "amarillo") utilizando simultáneamente el software de adquisición de imágenes respectivo (véase también 2.1.6). Por ejemplo, en el caso de destellos de luz (Figura 3B, C), registre al menos de 8 a 10 presentaciones de estímulos (ensayos).

Resultados

Figura 1. Preparación de cortes verticales de retina. (A) Retina aislada y aplanada preparada para el corte. (B) Pieza rectangular de retina (ver recuadro rojo en A) montada sobre una membrana de papel de filtro (gris oscuro) ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Grasa de alto vacío	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Cubrecubiertas	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Guías de vidrio	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Cuchillas para picadora de tejidos	MARTOR KG	ARGENTAX Nº 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Picadora de tejidos	Membrana
			filtro: 0,8 μm; http://www.emdmillipore.com
Estimulador de campo completo basado en LED UV/verde	Placa
microprocesador de código abierto	Arduino		http://www.arduino.cc
Software de imagen CfNT	Escrito		a medida Desarrollado por Michael Müller, MPI para Investigación Médica, Heidelberg, Alemania
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 Enfoque del sistema sistema de perfusión	ALA Instrumento científico		colector de punta de 100 μm de diámetro; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Microscopio de objetivo móvil (MOM), diseñado por W. Denk, MPImF, Heidelberg, Alemania	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
Objetivo XLUMPlanFL 20x/0.95w	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Leica MZ95	Leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/

filtrante de nitrocelulosa a medida rejilla Merck Millipore AABG01300 Tipo de de con