Imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller durante la regeneración de la retina del pez cebra

Resumen

Fuente: Lahne, M., et.al. Cultivo de explantes de retina de pez cebra transgénico adulto para obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía multifotónica. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller en explantes de retina de pez cebra incrustados en agarosa después del daño de los fotorreceptores inducido por la luz. El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) liberado por los fotorreceptores dañados activa las células gliales de Müller, desencadenando la migración nuclear a través de las capas nucleares interna y externa para la mitosis y la generación de progenitores neuronales. Las imágenes capturadas revelan la dinámica de la migración nuclear y la diferenciación de los progenitores durante la regeneración de la retina.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1.

NOTA: Los experimentos realizados en este manuscrito fueron optimizados para un microscopio multifotónico equipado con un láser infrarrojo (ver Tabla de Materiales), un objetivo de inmersión en agua de larga distancia 40X Apo (N.A. 1.15), un escáner galvanómetro y una cámara ambiental que contiene un inserto para cuatro placas de Petri de 35 mm. Las imágenes se adquirieron con un detector no desescaneado (R-NDD).

1. Antes de la toma de imágenes, equilibre la cámara ambiental para lograr una atmósfera de 5% de_CO2 / aire. Asegúrese de que las placas de Petri vacías estén insertadas en el soporte para evitar fugas de gas en la habitación.
2. Encienda el sistema de microscopía.
3. Una vez que la cámara ambiental esté equilibrada, agregue líquido de índice de refracción sobre el objetivo de inmersión en agua de larga distancia 40X Apo (N.A. 1.15).
   NOTA: El líquido de índice de refracción con propiedades ópticas similares al agua se utiliza para evitar la evaporación del agua durante la obtención de imágenes a largo plazo.
4. Coloque placas fluoradas con explantes de retina en la cámara. Usando luz de campo claro, coloque el espécimen en la trayectoria de la luz y lleve la región media de la retina dorsal al plano de enfoque.
5. Utilice la luz epifluorescente GFP para enfocar los núcleos glia de Müller positivos para gfap:nGFP (Figura 1A, C).
   NOTA: Si los explantes no están montados planos o la agarosa se acumula debajo del explante, será difícil enfocar los núcleos gfap:nGFP-positivos o emitirán una fluorescencia tenue.
   1. Comprueba si mover a una región diferente dentro del mismo explante de retina superará el problema de enfoque. De lo contrario, muévase a un explante de retina diferente.
6. En el software de adquisición de imágenes, abra las ventanas 'A1 MP GUI', 'TiPad', 'A1 Compact GUI' y 'ND acquisition'. Para la adquisición de imágenes multifotónicas, asegúrese de que la opción 'IR NDD' esté elegida en la 'A1 Compact GUI'.
7. En el campo 'configuración', seleccione IR-DM para el 1er espejo dicroico y elija el filtro de paso de banda 525/50 para adquirir la fluorescencia GFP.
8. Encienda el láser IR en la ventana etiquetada como 'A1MP GUI'. El láser tardará unos minutos en estar listo. Establezca la longitud de onda en 910 nm para excitar la fluorescencia GFP y alinee el láser haciendo clic en el botón 'Alineación automática' en la ventana 'A1 MP GUI'.
9. Asegúrese de que las luces de la habitación y del equipo estén apagadas o cubiertas antes de abrir el obturador en la 'GUI A1 MP' para evitar la sobreexposición del tubo fotomultiplicador. Para reducir los niveles de ruido, coloque el microscopio en un entorno oscuro.
10. Adquiera imágenes de un campo de visión de 300 x 300 píxeles, con un zoom de dos y un tiempo de permanencia de píxeles de 4,8 μs/píxel. Configure aproximadamente la potencia del láser cambiando el 'área de adquisición' en la 'GUI A1MP' y la ganancia en la ventana 'A1 Compact GUI'.
11. Configurando el z-stack
    1. Concéntrese en la capa de células ganglionares (GCL) para establecer el plano focal superior de la pila z en la subventana 'z' dentro de la ventana 'ND acquisition'. Algunas células gfap:nGFP positivas se localizan normalmente en la capa de células ganglionares, lo que ayuda a identificar el límite basal de la retina (Figura 1A, D).
    2. Mueva el plano focal a través del nivel de la capa nuclear externa (ONL) (Figura 1A, B), que se caracteriza por la presencia de células positivas para gfap:nGFP débilmente marcadas que son redondas y agrandadas en relación con sus contrapartes en la capa nuclear interna (INL) (Figura 1A, C).
    3. Establezca este plano como la parte inferior de la pila z. Asegúrese de que se tomarán imágenes de todo el ONL (Figura 1A, B).
    4. Cuando experimente cambios de plano focal que requieran un reajuste durante el período de imagen, haga doble clic en la posición central en la subventana 'z' para asignarla como la posición 'inicio'. Cambie a 'modo simétrico definido' y haga clic en 'relativo'.
    5. Establezca el tamaño del paso z entre 0,7 y 1 μm.
12. Corrección de intensidad Z:
    1. Aplique correcciones de intensidad z para compensar la pérdida de intensidad de píxeles debido a la dispersión de la luz al obtener imágenes en capas profundas del tejido.
    2. Para configurar la corrección, abra la ventana 'Corrección de intensidad z'. Para establecer el 'rango de pila z', elija 'Desde ND'.
    3. Haga clic en el plano focal inferior en la ventana 'Corrección de intensidad z' (en este caso, corresponde a la capa de células ganglionares) y configure la intensidad del láser ('área de adquisición' en la 'GUI A1MP') y la ganancia (GUI A1 Compacta).
    4. Haga clic en la flecha junto a los 'valores z' en la ventana 'Corrección de intensidad z' para confirmar los ajustes que se muestran posteriormente en 'Configuración del dispositivo' en la ventana 'Corrección de intensidad z' para el plano focal elegido.
    5. Repita el proceso para los planos medio y superior, aumentando la potencia y la ganancia del láser. Se pueden agregar planos focales adicionales si es necesario. Consulte la Tabla 1 para conocer los ajustes específicos del láser y la ganancia para los experimentos en las Figuras 1 a 3.
    6. Establezca el 'área de adquisición' en la ventana 'A1 MP GUI'. Evite seleccionar un área de adquisición mayor que 15 y una ganancia superior a 126 al inicio de la imagen para evitar el fotoblanqueo y el aumento de los niveles de ruido.
       NOTA: Dado que los láseres y los tubos fotomultiplicadores difieren entre los sistemas de microscopía, pruebe los ajustes del láser y de ganancia para obtener las condiciones óptimas de imagen para la configuración del microscopio y evitar el fotoblanqueo.
    7. Elija 'corrección de intensidad relativa' en la ventana 'Corrección de intensidad z'.
13. En la subventana 'series temporales' en la ventana 'Adquisición ND', establezca la duración en 8 h y el intervalo en 'sin retraso'. A continuación, asegúrese de hacer clic en 'Ejecutar corrección z' en la subventana 'pila z' en el botón de la ventana 'Adquisición ND' para adquirir la serie temporal 3D.
14. Mantener los explantes de retina a una temperatura de 27 a 29 °C durante toda la adquisición de la imagen.
15. A lo largo del período de adquisición de la imagen, si es necesario, reajuste el nivel de potencia y la ganancia para mantener la calidad de la imagen para el análisis posterior a la imagen. Para los ajustes, realice los pasos 1.11.2 - 1.11.4.
16. Si el plano focal se desplaza, pausa o detiene la ejecución y vuelve a realizar el paso 1.11.
    NOTA: Si se eligió la 'corrección z relativa' en el paso 1.12.7 y se realizó el paso 1.11.4, no debería ser necesario reajustar los niveles de potencia y ganancia, a menos que se haya producido un fotoblanqueo extenso.

Tabla 1: Láser y niveles de ganancia utilizados para las correcciones de intensidad z en los diferentes planos de los experimentos que se muestran en las Figuras 1 a 3.

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	Potencia del láser	Ganancia	Potencia del láser	Ganancia
Superior (fotorreceptor de bastone)	13	126	3,5	118
Medio (glía de Müller)	10	126	2,8	118
Fondo (capa de células ganglionares)	8	126	2,1	118

Resultados

Figura 1: Reconstrucción 3D de pilas Z multifotónicas de retina. A) Reconstrucción en 3D de una serie de imágenes multifotónicas z-stack de células gfap:nGFP-positivas en cultivos de retina de montaje completo de pez cebra después de 48...

Materiales