Imágenes de daño cerebral inducido por hipoxia-isquemia cerebral en un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Ouyang, Y., et al. Imágenes simultáneas de PET/MRI durante la hipoxia-isquemia cerebral en ratones. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra una técnica para evaluar la lesión por hipoxia cerebral a través de la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (RM) simultáneas. Un ratón anestesiado se somete a una ligadura de la arteria carótida común (CCA), lo que reduce el flujo sanguíneo a un hemisferio cerebral y lo predispone a lesiones inducidas por hipoxia. La PET y la RMN evalúan el metabolismo de la glucosa y los cambios estructurales durante la hipoxia. La resonancia magnética detecta la difusión restringida del agua, mientras que la PET revela una menor absorción de glucosa, lo que indica estrés celular inducido por hipoxia y deterioro metabólico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Ligadura unilateral de la arteria carótida común (CCA)

1. Prepare un campo estéril con herramientas y materiales quirúrgicos esterilizados colocados convenientemente. Asegúrese de que la almohadilla térmica se caliente a 37 °C con la sonda de temperatura colocada de forma segura en la almohadilla. Asegúrese de usar un paño estéril para cubrir el sitio quirúrgico.
2. Anestesiar al animal (isoflurano, 1-3% en el aire a 0,5-1 L/min) y colocarlo en posición supina con la cola hacia afuera. Verifique la anestesia pellizcando el dedo del pie, esto no debería provocar ninguna reacción si el animal está debidamente anestesiado. Aplique ungüento oftálmico en los ojos.
3. Aplique la crema depilatoria en la parte inferior del cuello hasta la parte superior del pecho con 1 o 2 hisopos de algodón. Espere de 1 a 3 minutos y luego elimine el vello y la crema con gasa húmeda o hisopos con alcohol. Frote el área de la incisión con Betadine de manera circular de adentro hacia afuera y luego cámbielo a guantes quirúrgicos estériles.
4. Con unas tijeras quirúrgicas, haga una incisión de alrededor de 1 cm a lo largo de la línea media de la parte inferior del cuello. Separe cuidadosamente la piel exterior de la fascia circundante con unas tijeras quirúrgicas.
5. Con dos pinzas de sutura de microiris McPherson, separe la arteria carótida común derecha de la fascia, teniendo cuidado de evitar dañar las venas o alterar el nervio vago.
6. Con las pinzas de la derecha, exteriorice el CCA derecho en una posición estable. Aplica varias gotas de solución salina para evitar que se seque. Pasar una longitud adecuada (2-3 cm) de sutura de seda 6-0 por debajo del CCA derecho y ligar con un nudo cuadrado doble. Opcionalmente, vuelva a ligar con un segundo tramo de sutura de seda 6-0.
7. Vuelva a colocar el CCA derecho y limpie el exceso de líquido para que no se abra con un hisopo estéril con punta de esponja. Cierre la incisión con una sutura de seda 6-0. Aplicar lidocaína por vía tópica hasta 7 mg/kg.
8. Permita que el animal se recupere de la anestesia hasta que esté ambulatorio (aproximadamente 30 min) y realice un seguimiento postquirúrgico hasta que el animal esté listo para la toma de imágenes.

2. Preparación para la obtención de imágenes: comprobaciones del sistema y

1. del hardware Configure el hardware y el software para los sistemas de resonancia magnética y PET y compruebe su funcionalidad de la siguiente manera. Asegúrese de que todas las conexiones físicas sean seguras y de que la configuración del software esté seleccionada correctamente.
   1. Asegúrese de que el sistema de PET esté a la temperatura de funcionamiento prescrita de 5 °C utilizando el sistema de enfriamiento por aire.
   2. Monte el sistema PET dentro del orificio de la resonancia magnética, alineando los centros del campo de visión (FOV) de la PET y la resonancia magnética utilizando desplazamientos axiales conocidos. Monte la bobina de resonancia magnética dentro del orificio del sistema PET y centre la bobina con el sistema de PET y los centros magnéticos de resonancia magnética
   .
   3. Encienda la electrónica PET para la alimentación y el voltaje de polarización (Nota: los pasos variarán según el instrumento). Realice un escaneo rápido (5 minutos) con un cilindro de 68Ge y verifique el sinograma resultante para asegurarse de que todos los detectores estén operativos.
   4. Opcionalmente, adquiera datos que se utilizarán para una matriz de transformación PET/MRI con fines de corregistro: Llene un maniquí tridimensional (por ejemplo, tres esferas llenas) con 200 μCi de solución acuosa de 18F y adquiera durante 15 minutos con PET. Adquisición de datos anatómicos de resonancia magnética: en la ventana de control de exploración, seleccione la secuencia de ecocardiograma múltiple (MSME) (consulte la Tabla 1). Repita para las tres orientaciones principales: axial, sagital y coronal.
2. Compruebe los ajustes y el funcionamiento de la bomba de infusión. Ajuste la bomba a 4,44 μl por minuto, que en 45 minutos de infusión constante proporciona un volumen total de 200 μl, el límite típico recomendado para la inyección intravenosa (i.v.) en un animal de 20 g.
3. Compruebe el funcionamiento del calentador y confirme que la temperatura de salida es suficiente para mantener al animal caliente (37 °C). Verifique que el monitoreo de la temperatura y las vías respiratorias esté operativo en preparación para la colocación de los animales en la cama del animal.
4. Compruebe el funcionamiento de los caudalímetros de O2 y N2 (para 0,5 L/min: O2 a 57,2 mg/min y N2 a 0,575 g/min) encendiendo ambos con la fuente de aire comprimido apagada y las fuentes de O2 y N2 encendidas. Para evitar el riesgo de dañar los caudalímetros, no los encienda sin suficiente presión de entrada.
5. Asegúrese de que el vaporizador de isoflurano esté lo suficientemente lleno. Antes de la toma de imágenes, comience el flujo de anestesia con isoflurano al 1-2% y de 0,5 a 1 L/min.
6. Prepare la cama del animal asegurándose de que la anestesia, la almohadilla respiratoria y los sistemas de calefacción estén colocados de manera segura y funcional. Para una mayor precisión en el registro conjunto de PET/RMN, se pueden colocar marcadores de referencia (por ejemplo, tubos capilares llenos de radiotrazador a una concentración similar a la inyectada para la obtención de imágenes) en el lecho del animal dentro del campo de visión.

3. Flujo de trabajo de imágenes

Una vez completadas todas las comprobaciones necesarias del equipo, proceda a la obtención de imágenes de la siguiente manera:

1. Anestesiar al animal con isoflurano e insertar un catéter para la vena de la cola (aguja de 28 G, tubo de PE-10 de menos de 5 cm) lleno de solución salina heparinizada (0,5 ml de heparina, 1.000 USP/ml, en solución salina de 10 ml). Calentar al animal y/o la cola puede mejorar la precisión de la inserción del catéter. Opcionalmente, coloque una gota de adhesivo de cianoacrilato en el sitio de inserción para asegurar la vía intravenosa.
2. Transfiera el animal a la cama preparada. Asegúrese de que la cabeza del animal esté segura, con los incisivos superiores asegurados por la barra dentaria y las barras de las orejas en su lugar si se utiliza.
3. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar que se sequen. Inserte el termómetro de sonda rectal. Asegúrese de que las lecturas de temperatura y respiración funcionen.
4. Extraiga la dosis de radiotrazador (alrededor de 600 μCi en 200 μl) que se inyectará en un tubo de PE-10 heparinizado de longitud adecuada: aproximadamente 3 m para el tubo de PE-10 y un volumen de 200 μl. Conecte un extremo de este tubo a la jeringa de la bomba de infusión y el otro a la línea del catéter de la vena de cola. teniendo cuidado de no crear pinchazos en el tubo.
5. Deslice la cama del animal hacia adelante en el orificio del imán, asegurándose de no alterar la posición de la bobina de resonancia magnética y cualquier línea o cable, especialmente el tubo de anestesia. Asegúrese de que el centro del cerebro esté alineado con los centros de la bobina de resonancia magnética, el sistema PET y el imán de resonancia magnética.
6. Realice la sintonización y adaptación de la bobina de resonancia magnética girando las perillas de ajuste de la bobina, minimizando los desajustes de impedancia (verifique las especificaciones de la bobina) y frecuencia (300 MHz para 1H a 7 Tesla) observando la pantalla del preamplificador de alta potencia.
7. (MRI) Después de afinar y emparejar, adquiera una imagen de exploración: seleccione una secuencia de tripiloto de Rapid Imaging with Refocused Echoes (RARE) y ejecute la secuencia desde la ventana de control de escaneo. Compruebe la posición del animal, repitiendo los pasos 3.5 y 3.6 según sea necesario. Restablezca las cuñas al valor cero.
8. (IRM) Adquiera una exploración espectroscópica localizada y puntual (PRESS) en un volumen dentro del cerebro: Ejecute una secuencia PRESS (consulte la Tabla 1) en un volumen rectangular con dimensiones de 3,9 mm × 6 mm × 9 mm. Compruebe el ancho de la línea de agua utilizando el comando de macro CalcLineWidth. Si el valor de ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) es aceptable (por ejemplo, 0,2 ppm), continúe con el paso 3.10. Si no es así, continúe con el paso 3.9.
9. (MRI) Adquirir un mapa de campo: Ejecute una secuencia de FieldMap (consulte la Tabla 1). Utilice los datos resultantes para una cuña de proyección multiángulo (MAPSHIM) ejecutando el comando de macro MAPSHIM y seleccionando ajustes locales lineales y de segundo orden (z2). Repita el paso 3.8.
10. (MRI) Coloque el plan de corte para la exploración de imágenes ponderadas por difusión (DWI) (consulte la Tabla 1): con el Editor de geometría, asegúrese de que el campo de visión de adquisición esté posicionado para adquirir el volumen deseado de interés dentro del cerebro. Si el plan de corte resultante está alineado como se desea, copie este plan de corte en la ventana de control de escaneo para todos los escaneos de DWI posteriores. Comenzar la adquisición.
11. (PET) Con la adquisición de PET preparada y lista para comenzar, ponga en marcha la bomba de infusión. Después del retraso predeterminado en el que se ha inyectado la solución salina del catéter, se debe iniciar la adquisición de la PET (ver Tabla 1) con el fin de capturar la entrada de la radiosonda. Controle la tasa de conteo y busque un aumento gradual en los recuentos indicativo de una inyección exitosa.
12. Después de 10-15 minutos, inicie el desafío hipóxico simultáneamente con el paso 3.12. Para iniciar el desafío hipóxico, apague el flujo de aire medicinal y encienda inmediatamente los medidores de flujo de O2 y N2 con los ajustes predeterminados para suministrar un 8 % de oxígeno y un 92 % de nitrógeno, y reducir el isoflurano al 0,8 %. No encienda los medidores de flujo sin presión de entrada.
13. (MRI) Al mismo tiempo que en el paso 3.12, comience la adquisición de DWI preparada en el paso 3.10 (escaneo "H1").
14. (MRI) Comience la adquisición de DWI (escaneo "H2"), preparado en el paso 3.10, inmediatamente después de que se complete el escaneo H1. Ponga fin al desafío hipóxico apagando los caudalímetros, restaurando el flujo de aire medicinal y devolviendo la concentración de isoflurano a un valor adecuado según el monitoreo fisiológico.
15. (MRI) Adquiera una exploración DWI post-hipoxia preparada en el paso 3.10. Apague la bomba de infusión una vez finalizada esta exploración.
16. (Resonancia magnética) Adquirir imágenes anatómicas en los planos axial y sagital. En la ventana de control de escaneo, seleccione la secuencia de MIPYME (consulte la Tabla 1). Con el Editor de geometría, asegúrese de que el campo de visión de adquisición cubra el cerebro.
17. Retirar al animal, devolverlo a la jaula cuando esté ambulatorio y vigilar los signos de morbilidad, sacrificar si es necesario con la administración de CO2 seguido de luxación cervical como método secundario.

Tabla 1. Parámetros de secuencia de pulsos de resonancia magnética para exploraciones descritos en el protocolo, y parámetros de adquisición, histograma y reconstrucción por PET.

Parámetros de adquisición de imágenes y difusión
MRI (EPI-DWI)
Tiempo de adquisición	15 min
Tamaño de la matriz	256 x 64
Rebanadas	10
FOV	30 x 14 x 8 mm
Tamaño del vóxel	0,117 x 0,219 x 0,8 mm
Ancho de banda espectral efectivo	150 kHz
TE	41 mseg
TR	3.000 mseg
Promedia:	6
segmentos de k-espacio	16
b	, 400, 800 seg/mm2
Resonancia magnética anatómica (MSME)
Tiempo de adquisición	5 min
Tamaño de la matriz	256 x 256
Rebanadas:	16
FOV	30 x 22 x 12,8 mm
Tamaño del vóxel	0,117 x 0,086 x 0,8 mm
TE	14 mseg
TR	1.000 mseg
Promedios 1
Repeticiones	1
Escaneo espectroscópico con resolución puntual (PRESS)
Tiempo de adquisición	15 s Tamaño del
vóxel	3,9 x 6 x 9 mm
TE	20 mseg
TR	2.500 mseg
Promedios	6
FieldMap
Tiempo de adquisición	1 min 21 seg
1º TE	1,49 mseg
2º TE	5,49 mseg
TR	20 mseg
Promedios	1
Adquisición de PET, histograma, y Parámetros de Reconstrucción
Tracer	[18F]FDG
Velocidad de infusión	4,44 μL/min
Tiempo de adquisición	60 min
Tamaño de la imagen por corte	128 x 128
Rebanadas	99
Tamaño de vóxel	0,4 x 0,4 x 0,6 mm
Encuadre dinámico	12 x 300 seg
Tipo de reconstrucción	: OS-MLEM (6 subconjuntos, 6 iteraciones)

de adquisición de hardware, valores 0: : : : : : :

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cirugía
Tijeras quirúrgicas	Pinza Roboz	RS-5852
	Roboz	RS-5237
Pinza para mosquitos Hartman	Miltex	7-26
2x Pinzas de sutura McPherson, 8,5 cm	Instrumentos quirúrgicos y científicos precisos	4473	Es útil reducir el ancho de apertura con una banda en las pinzas utilizadas para sujetar la arteria carótida
6-0 sutura de seda trenzada recubierta de silicona con aguja 3/8 C-1	Covidien Sofsilk	S-1172
Sistema de manta homeotérmica	Harvard Apparatus	507220F
Super pegamento	(genérico)
Caudalímetro de hipoxia
para O₂	Alicat Scientific	MC-500SCCM-D
Flometer para N₂	Alicat Scientific	MC-5SLPM-D
Medidor de O₂	MSA	Altair Pro
Imagen
7.05 Tesla Sistema de resonancia magnética	Bruker	BioSpec	20 cm de diámetro interior con gradiente establecido. Software Paravision 5.1.
Volumen Tx/Rx Bobina 1H, 35mm ID	PET Bruker	T8100
	(Interno)		4x24 detectores LSO-PSAPD,
10x10 LSO array por detector,
paso de cristal de 1,2 mm y 14 mm de profundidad. 14 x 14 mm PSAPD. Campo de visión: 60x35mm. Ventana de energía de 350-650 keV. Ventana de temporización de 16 ns.
Canulación de vasos Pinza Dumont	Roboz	RS-4991
PE-10 tubo de polietileno	BD Intramedic	427401
bomba de infusión	Braintree Scientific	BS-300
Equipo de monitoreo y compuerta de animales	Small Animal Instruments Inc.	Modelo 1025	Solo se utiliza el control de la respiración
Cama para animales con regulación de temperatura	(Interna)

Sistema