Imágenes de lapso de tiempo de células de la corteza cerebral primarias de ratón transfectadas

Resumen

Fuente: Landeira, B. S.,et al., Imágenes en vivo de células de la corteza cerebral primaria utilizando un sistema de cultivo 2D. J. Vis. Exp. (2017)

El video demuestra el uso de imágenes de lapso de tiempo para rastrear progenitores corticales marcados con fluorescencia, monitorear su división y diferenciación, y estudiar el desarrollo del linaje en las células de la corteza cerebral primaria

Protocolo

1. Videomicroscopía de lapso de tiempo

NOTA: Este paso requiere un microscopio de fluorescencia invertida con una cámara de incubación (ver Tabla de Materiales).

1. Después de la infección por retrovirus, coloque la placa de cultivo de tejidos en una incubadora conectada a los controladores de temperatura y CO₂.
   NOTA: El precalentamiento de la cámara durante 3 h antes de iniciar la obtención de imágenes podría ayudar a minimizar la deriva y el desenfoque durante la adquisición.
   NOTA: La cámara debe mantener las celdas en condiciones constantes de 37 °C y 5% de CO₂.
2. Seleccione una posición en el eje XY para que actúe como punto cero (XY = 0). Esto permitirá una referencia para volver a encontrar las posiciones en el futuro.
   NOTA: Es aconsejable dibujar un signo en la placa que pueda servir de referencia para determinar el punto cero.
3. Seleccione las posiciones que se visualizarán con un aumento de 10X.
   NOTA: Seleccione de 10 a 15 posiciones por pocillo para aumentar la probabilidad de observar células transfectadas retroviralmente.
   NOTA: Se pueden utilizar objetivos de gran aumento a larga distancia (20X o 40X) para obtener imágenes de mayor resolución. Dependiendo de la distancia de trabajo de los objetivos, es posible que se requieran placas con fondo de vidrio.
4. Adquiera imágenes de contraste de fase cada 5 minutos e imágenes de fluorescencia cada 3 horas para disminuir la fototoxicidad. Verifique y ajuste el enfoque en las primeras 3 h del experimento, ya que puede cambiar mientras la temperatura se equilibra. Verifique y ajuste el enfoque diariamente.
   NOTA: Observamos que el enfoque se estabiliza después de las primeras 24 h. Sin embargo, es aconsejable controlar el enfoque. También puede utilizar un sistema de enfoque automático basado en software.
5. Después de 7 días, detenga la adquisición.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zurich
Microscopio de observador celular	Zeiss
The Tracking Tool (tTt) software		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html