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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Tinción fluorescente de interneuronas vivas
1. Transfiera las rodajas cerebelosas con una pipeta Pasteur truncada de vidrio de gran diámetro a una placa de 6 pocillos (máx. 3 rodajas/pocillo). Aspire el medio de solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks.
2. Incubar rodajas (3 máx.) en 5 ml de solución de carga del colorante fluorescente (10 μM).
3. Para protegerlo de la luz, cubra la microplaca con papel de aluminio. Colóquelo en una mesa de movimiento giroscópico a 35 rpm durante 10 min en RT para facilitar el etiquetado de la celda.
4. Transfiera cortes en la membrana de un inserto Transwell (tamaño de poro de 3.0 μm; Figura 1D) con una pipeta Pasteur truncada de vidrio de gran diámetro. Aspire el medio de carga con una pipeta.
5. Retire el inserto y llene el pocillo con 1,9 ml del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM). Vuelva a colocar el inserto y agregue 100 μl de DMEM encima de la rebanada para cubrir el tejido.
6. Coloque la placa que contiene los insertos de cultivo en la cámara de la incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 2 horas, lo cual es suficiente para observar las células granulosas (GC) en la capa molecular (ML). Coloque los tejidos planos para permitir la fijación en la membrana del inserto (Figura 1E). Asegúrese de que las rodajas no se sequen.
2. Imágenes ex vivo a través de macroscopía confocal
1. Transfiera la placa sin la tapa de plástico a una incubadora conectada al soporte de un macroscopio confocal. Coloque una cubierta de vidrio en el inserto de la placa del macroscopio. Mantenga la temperatura de la cámara a 37,0 °C ± 0,5 °C y suministre las rodajas con un flujo de gas constante (95% O2, 5% CO2) a través del inserto de la placa para mantener el pH constante. Espere 2 horas más antes del experimento de lapso de tiempo.
2. Para visualizar la migración de GC en los cortes de tejido, ilumine la preparación con una luz de longitud de onda de 488 nm por medio de un diodo láser a través de un macroscopio de escaneo láser confocal equipado con un objetivo seco X2 (distancia de trabajo: 39 mm, diámetro: 58 mm, NA = 0.234), y detecte la emisión de fluorescencia de 500 a 530 nm.
1. Para resolver con precisión el movimiento de los GCs, adquiera imágenes con un factor de zoom óptico adicional de 1.5 a 2.0. Recopile imágenes de GC en un solo plano focal o hasta 10 planos focales diferentes a lo largo del eje z cada 30 minutos durante un máximo de 12 horas.
3. Cuando sea necesario, retire la cubierta de vidrio y agregue pequeños volúmenes (1-10 μl) de activadores o inhibidores biológicos en DMEM con una pipeta de 10 μl para estudiar su efecto en la migración de GC.
3. Seguimiento de celdas
1. Para cada momento de la película, realice la proyección z-stack a través del modo de tipo ecart en ImageJ. Module el contraste y los niveles de brillo de las imágenes sucesivas para facilitar la identificación y el seguimiento de los GC etiquetados. Mapee manualmente cada posición en la instantánea de referencia (at t = 0).
1. Utilice el complemento "Seguimiento manual" en el menú Analizar partículas y determine haciendo clic en el punto de gravedad de cada cuerpo de celda durante el lapso de tiempo. Exporta los datos de seguimiento sin procesar en una hoja de cálculo.
2. Reorganice los datos de seguimiento sin procesar exportados de ImageJ con un programa inteligente hecho en casa que identifica cada celda y las posiciones asociadas. Utilizando el programa, calcule la distancia total recorrida y la velocidad media de migración de cada celda. Clasificar y comparar las características de la migración celular en condiciones de control y tratamiento bajo filtros apropiados utilizando el mismo programa.
