Imágenes de lapso de tiempo de la división de células madre neurales de ratón mediante microscopía confocal

Resumen

Fuente: Daynac, M., et. al. Clasificación celular de células madre neurales y progenitoras de la zona subventricular de ratón adulto e imágenes en vivo de su dinámica del ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra imágenes de lapso de tiempo de células madre neurales (NSC) de un cerebro de ratón transgénico utilizando un microscopio de escaneo láser confocal. Las NSC emiten fluorescencia roja durante la fase G1 y no son fluorescentes en otras fases del ciclo celular. Se coloca un cultivo de NSC adherido en la cámara de imágenes, se establecen los parámetros de imagen y las imágenes se capturan a intervalos regulares durante la duración deseada.

Protocolo

1. Configuración básica antes del cultivo y la videomicroscopía

1. Utilice placas de cultivo con fondo de vidrio o placas de μ para la microscopía de vídeo confocal. Para 1 - 5 x 10³ celdas/pocillo, use placas de 96 pocillos, y para más de 5 x 10³ celdas/pocillo, use placas de 24 pocillos.
2. Al menos un día antes de comenzar el experimento, prepare placas estériles recubiertas de poli-D-lisina (PDL) para cultivos monocapa adherentes. Agregue suficiente PDL (10 μg/ml en agua destilada o dH₂O) para cubrir el fondo de cada pocillo e incube durante la noche (O/N) a 37 °C. Retire la solución de PDL y enjuague tres veces con dH₂O antes de dejar que la placa se seque en la campana durante al menos 2 horas bajo un flujo laminar. Si no se utiliza inmediatamente, guarde la placa recubierta a -20 °C.
3. Prepare el medio de cultivo mezclando el medio basal de células madre neurales (NSC) y el suplemento de proliferación de NSC en una proporción de 9:1 (consulte la tabla de materiales) junto con 2 μg/ml de heparina, 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) recombinante humano purificado y 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos recombinantes humanos 2 (FGF-2). Calentar el medio de cultivo a 37 °C en un baño de agua antes de usarlo.
4. Para la disociación de la zona subventricular (SVZ), prepare la solución de papaína: 1 mg/ml de papaína (15 UI/ml) en solución salina de Earl's Balance (EBSS) que contiene 0,2 mg/ml de L-cisteína, 0,2 mg/ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 0,01 mg/ml de DNasa I en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Esterilice la solución pasándola a través de un filtro de 0,2 μm. Equilibrar la solución a 37 °C antes de usar.
5. Para detener la reacción enzimática, prepare una solución de inhibidor de la proteasa (Ovomucoide): medio de águila modificado de dulbecco (DMEM): medio F12 que contiene 0,7 mg/ml de inhibidor de tripsina tipo II. Filtre la solución con un filtro de 0,2 μm.
6. Prepare la solución de glucosa al 0,6% de PBS para recoger los cerebros y la solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,15% de PBS para los pasos de lavado y para la tinción de anticuerpos.
7. Prepara las herramientas de disección: tijeras, pinzas para diseccionar y ligar, y un bisturí. Sumérjalos en etanol al 70%.

2. Recolección de cerebros de ratones adultos y microdisecciones SVZ

1. Sacrifica ratones adultos con indicador de ciclo celular de ubiquitinación fluorescente (FUCCI) (2 a 3 meses de edad y/o 12 meses de edad para estudios de envejecimiento), realizando una luxación cervical de acuerdo con las pautas institucionales apropiadas.
2. Rocíe el ratón con etanol al 70% y corte la cabeza con unas tijeras afiladas.
3. Haz una incisión a lo largo del cuero cabelludo para revelar el cráneo.
4. Realice un corte longitudinal de la línea media comenzando en la base del cráneo hacia los bulbos olfativos con un pequeño par de tijeras. Asegúrate de evitar dañar el cerebro subyacente con las hojas de las tijeras. Extirpa la parte superior abierta del cráneo con pinzas curvas para exponer el cerebro.
5. Recoja el cerebro en una placa de Petri de 15 mm que contenga 0,6% de glucosa en PBS.
6. Disecciona los bulbos olfativos. Coloca el cerebro en su superficie dorsal y haz una sección coronal a través del quiasma óptico con un bisturí.
7. Bajo un microscopio de disección, coloque la parte rostral de la sección del cerebro con la superficie coronal cortada hacia arriba, hacia el experimentador.
8. Para diseccionar la SVZ, extraiga el tabique con pinzas curvas finas, luego inserte una punta de una pinza fina en el cuerpo estriado inmediatamente adyacente al ventrículo y separe la SVZ del tejido circundante. Coloque el SVZ diseccionado en una placa de Petri que contenga 1 ml de glucosa PBS-0.6%.

3. Disociación del tejido SVZ Picar

1. el SVZ diseccionado en la placa de Petri hasta que no queden trozos grandes.
2. Transfiera el tejido picado junto con la glucosa PBS-0.6% a un tubo de 15 ml y centrifugue a 200 x g durante 5 min.
3. Deseche el sobrenadante y añada 1 ml de papaína precalentada (1 mg/ml, preparada en el paso 1.4) suplementada con 0,01 mg/ml de DNasa I. Incubar durante 10 min en un baño de agua a 37 °C. Utilice 1 ml de papaína por ratón.
4. Centrifugar a 200 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
5. Añadir 1 ml de ovomucoide precalentado (0,7 mg/ml, preparado en el paso 1.5) para detener la actividad de la papaína. Disocie mecánicamente el tejido picado en una suspensión unicelular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 20 veces a través de una punta de micropipeta p1000. Evite las burbujas de aire.
6. Pase la suspensión celular a través de un filtro estéril de 20 μm en un tubo nuevo de 15 ml. Asegúrese de lavar el filtro de celdas con PBS 0.15% BSA para evitar perder celdas.
7. Centrifugar a 200 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 100 μl de PBS que contengan 0,15% de BSA.

4. Tinción inmunofluorescente para la clasificación celular

Para la clasificación celular con ratones FUCCI-Red (Figura 1A), utilice los siguientes anticuerpos: CD24 conjugado ficoeritrina-cianina 7 [PC7]; Ligando de isotiocianato de fluoresceína CD15/LeX conjugado [FITC] y EGF conjugado con Ax647.

Nota: Las células LeX⁺EGFR⁺ y las células EGFR⁺ no son abundantes en la SVZ adulta: ≈ 600 y 1500 células/ratón, respectivamente. Recomendamos agrupar células SVZ de 2 a 3 ratones para tener suficiente material. No trabaje con más de 12 ratones el mismo día para que la duración de la clasificación de células no supere las 3 horas. Tenga en cuenta que trabajar con demasiados ratones en el mismo día conducirá a una mayor duración de la clasificación celular, lo que posiblemente resulte en una mayor muerte celular y/o diferenciación celular.

1. Realice la tinción FACS en 100 μl de PBS 0,15% BSA por ratón (o en 200 μl para un grupo de 2 a 3 ratones para una tinción óptima).
2. Prepare los tubos de control. Utilice perlas de compensación para preparar tubos de control de un solo color de acuerdo con el protocolo del fabricante. Seleccione una fracción de células (1/10 de las células extraídas de un ratón es suficiente) y sepárela en 4 tubos para preparar 1 tubo de control negativo (células no marcadas) y 3 tubos de control de fluorescencia menos uno (FMO). Vuelva a suspender las células en 200 μl de PBS 0,15% BSA por tubo.
   Sugerencia: Para el control de FMO LeX-FITC, etiquete las células con CD24-PC7 (1:50) y ligando EGF conjugado con Ax647 (1:200); para el control de CD24-PC7 FMO, etiquete las células con CD15/LeX-FITC (1:50) y el ligando EGF conjugado con Ax647 (1:200) y para el control FMO del ligando EGF conjugado con Ax647, etiquete las células con CD15/LeX-FITC (1:50) y CD24-PC7 (1:50).
3. Para los tubos utilizados para la clasificación de células, utilice los siguientes anticuerpos en la dilución indicada en PBS 0.15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) y ligando EGF conjugado Ax647 (1:200).
4. Incubar durante 20 min a 4 °C en la oscuridad. Lavar con 1 ml de PBS 0,15% BSA y centrifugar a 200 x g durante 10 min. Resuspender las células en 200 μl de PBS 0,15% BSA por cerebro. Mantenga los tubos de clasificación de celdas en hielo y proceda inmediatamente a la clasificación de celdas.
5. Si se utilizan ratones FUCCI-Green, separe las fracciones LeX-positivas y LeX-negativas utilizando columnas de separación antes de la clasificación celular, ya que el anticuerpo LeX-FITC comparte la misma longitud de onda de emisión que la fluorescencia FUCCI-green (Figura 2A, B).
   1. Primero, etiquete las células con un anticuerpo LeX anti-humano de ratón (1:50) durante 15 minutos a 4 °C en la oscuridad en 100 μl de PBS 0.15% BSA.
   2. Lavar las células con 1 ml de PBS 0,15% BSA y centrifugar a 200 x g durante 10 min, luego etiquetar las células con microperlas de IgM anti-ratón (1:10) durante 15 minutos a 4 °C en la oscuridad.
   3. Lavar las células con 1 ml de PBS al 0,15% BSA y centrifugar a 200 x g durante 10 min. Vuelva a suspender las células en 500 μl de PBS al 0,15% BSA y vierta las células a través de la columna de separación en el campo magnético como se esquematiza en la Figura 2C. Lavar la columna con 1 ml de PBS 0,15% BSA para obtener la fracción negativa de LeX.
   4. Para obtener una fracción LeX positiva, retire la columna de separación del campo magnético y eluya las células con 2 ml de PBS 0,15% BSA.
   5. Proceda a la tinción del ligando EGF conjugado con CD24-PC7 y Ax647 como se indica en 4.2.

5. Clasificación de células

Nota: Las células se clasificaron en un clasificador FACS a 40 Psi con una boquilla de 86 μm. La fluorescencia se recolectó utilizando el siguiente conjunto de filtros: 520/35 nm (FITC), 575/26 nm (PE), 670/20 nm (Ax647) y 740LP (PC7). La compensación es necesaria para evitar señales falsas positivas, ya que se encuentra una superposición entre los espectros de emisión de la fluorescencia roja FUCCI y el colorante PC7.

1. Inmediatamente antes de la clasificación de células, agregue un tinte vital para discriminar las células vivas de las muertas. Utilizamos Hoechst (HO) (ver tabla de materiales) a una concentración final de 2 μg/ml. Pase el tubo de control negativo (celdas sin marcar) a través del clasificador FACS y seleccione las celdas utilizando los parámetros de dispersión lateral (SSC) y dispersión directa (FSC) (Figura 3A).
   NOTA: Las celdas muertas se excluyeron conectando solo la fracción negativa de HO (Figura 3A), y luego se excluyeron los dobletes seleccionando la fracción negativa de ancho de pulso (Figura 3A).
2. Ejecute los controles de un solo color preparados en el paso 4.2 y ajuste los voltajes del tubo fotomultiplicador (PMT) si es necesario (es decir, población negativa demasiado alta y/o celdas positivas fuera de escala). Realice la compensación de color en la ventana de compensación del software.
3. Ejecute los controles FMO preparados en el paso 4.2 (control FMO LeX-FITC, control FMO CD24-PC7 y control FMO del ligando EGF conjugado con Ax647) y dibuje las puertas de clasificación (Figura 3). Clasificar las células directamente en 100 μl de medio de cultivo en microtubos de 1,5 ml.

6. Preparación de células para microscopía

1. Coloque las células recién clasificadas a una densidad de 1 - 3 x 10³ células/pocillo en una placa de μ de 96 pocillos recubierta de poli-D-lisina con 300 μl de medio de cultivo.
2. Antes de la microscopía de vídeo, incubar las placas de cultivo a 37 °C y 5% de CO₂ durante al menos 1 hora para permitir la adhesión de las células.

7. Configuración del microscopio y adquisición de imágenes

1. Realice imágenes en vivo utilizando un objetivo Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) en un sistema de microscopio de escaneo láser confocal conectado a una cámara termostatizada invertida a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO₂.
2. Coloque la placa de μ de 96 pocillos dentro de la cámara termostatizada precalentada y equilibrada y reemplace la tapa con una cubierta termostatizada.
3. Abra el software NIS-Elements y haga clic en la barra de menú en "Adquirir/Adquirir controles/Adquisición ND" para seleccionar las opciones del lapso de tiempo (longitud, posiciones de etapa, secciones Z confocal,...), "Adquirir/Controles de adquisición/Ti Pad" para seleccionar los objetivos y "Controles de adquisición/Adquisición/Ajustes A1plus" para seleccionar el nivel de PMT para cada fluorescencia en la barra de menú. Seleccione una carpeta para guardar los archivos de datos.
4. Usando la ventana de adquisición ND, establezca el centro de cada pozo como una posición de escenario y seleccione la opción de imagen grande en 7 x 7 mm². Esto creará una imagen de mosaico alrededor del centro de cada pozo. Establezca la superposición de la imagen de mosaico grande en 5%. Tome fotografías cada 20 minutos durante 24 horas. Seleccione el objetivo Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) en la ventana Ti Pad.
5. En la ventana Configuración de A1plus, adquiera imágenes utilizando un escáner resonante de alta velocidad en un formato de 512 x 512 píxeles con una resolución de 1,26 μm/píxel. Utilice el campo claro para visualizar las formas de las celdas. En el caso de los ratones FUCCI-Red, excite la fluorescencia roja a 561 nm y recoja con un filtro de 595/50 nm. En el caso de los ratones FUCCI-Green, excite la fluorescencia verde a 488 nm y recoja con un filtro de 530/40 nm. Determine el nivel óptimo de PMT, el desplazamiento y la potencia del láser para cada longitud de onda.
   NOTA: Recomendamos utilizar la función de enfoque automático para el canal de campo claro para permitir que el software enfoque automáticamente en cada posición de la etapa antes de cada adquisición. Sugerencia: Se utilizó un objetivo Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) por su excelente resolución sin necesidad de aceite. Se pueden utilizar otros objetivos en función de la resolución óptica deseada.
6. Seleccione el botón "Ejecutar ahora" en la ventana de adquisición de ND para comenzar la adquisición.

Resultados

Figura 1: Análisis en vivo del ciclo celular utilizando ratones FUCCI-Red. (A) Representación esquemática del ciclo de células FUCCI-Red, donde las células son rojo-fluorescentes durante la G₁ fase e incoloro durante las fases S-G...

Materiales