Imágenes de lapso de tiempo de la división de células madre neurales de ratón mediante microscopía confocal

Resumen

Fuente: Daynac, M., et. al. Clasificación celular de células madre neurales y progenitoras de la zona subventricular de ratón adulto e imágenes en vivo de su dinámica del ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra imágenes de lapso de tiempo de células madre neurales (NSC) de un cerebro de ratón transgénico utilizando un microscopio de escaneo láser confocal. Las NSC emiten fluorescencia roja durante la fase G1 y no son fluorescentes en otras fases del ciclo celular. Se coloca un cultivo de NSC adherido en la cámara de imágenes, se establecen los parámetros de imagen y las imágenes se capturan a intervalos regulares durante la duración deseada.

Protocolo

1. Configuración básica antes del cultivo y la videomicroscopía

1. Utilice placas de cultivo con fondo de vidrio o placas de μ para la microscopía de vídeo confocal. Para 1 - 5 x 10³ celdas/pocillo, use placas de 96 pocillos, y para más de 5 x 10³ celdas/pocillo, use placas de 24 pocillos.
2. Al menos un día antes de comenzar el experimento, prepare placas estériles recubiertas de poli-D-lisina (PDL) para cultivos monocapa adherentes. Agregue suficiente PDL (10 μg/ml en agua destilada o dH₂O) para cubrir el fondo de cada pocillo e incube durante la noche (O/N) a 37 °C. Retire la solución de PDL y enjuague tres veces con dH

Resultados

Figura 1: Análisis en vivo del ciclo celular utilizando ratones FUCCI-Red. (A) Representación esquemática del ciclo de células FUCCI-Red, donde las células son rojo-fluorescentes durante la G₁ fase e incoloro durante las fases S-G.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
96-well placas de cultivo con fondo de vidrio sin recubrimiento	MatTek Corp.	P96G-1.5-5-F
Placas de μ 96 pocillos	Ibidi	89626
Poly-D-Lisina	Millipore	A003E
NeuroCult NSC Medio basal	STEMCELL Technologies	5700
NeuroCult NSC Suplemento de proliferación	STEMCELL Technologies	5701
Heparina	STEMCELL Tecnologías	7980
EGF	Millipore	GF144
FGF-2	Millipore	GF003
Papain	Worthington	LS003119
EBSS	Invitrogen	24010-043
L-cisteína	Sigma	C-7352
0.5M EDTA, pH 8.0	Promega	V4231
DNasa I	Sigma	D5025-15KU
Inhibidor de tripsina tipo II	Sigma	T9128	Ovomucoid
DMEM:F12 medio	Life Technologies	31330-038
Filtro de 20 μm	BD Medimachine Filcon	340622
Eppendorf microtubos 3810X	Sigma	Z606340-1000EA
BSA	Sigma	A1595	Solución de albúmina sérica bovina
CD24 ficoeritrina-cianina conjugada 7 [PC7]	Life Technologies	A14776	IgM de ratón; clon MMA. 1:50
Isotiocianato de fluoresceína CD15/LeX [FITC] - conjugado	BD Biosciences	332778	Rata IgG2b; clon M1/69. 1:50
Ratón anticuerpo LeX antihumano	BD Pharmingen	559045	IgM de ratón; clon MAM. 1:50
Alexa647 - ligando de EGF conjugado	Life Technologies	E35351	1:200; Ligando de EGF conjugado con Ax647
CompBeads	BD Biosciences	644204
MACS LS Columnas de separación	Miltenyi Biotec	130-042-401	Columnas de separación
Microperlas de IgM antiratón	Miltenyi Biotec	130-047-301
Hoechst 33258	Sigma	861405
Clasificador de células INFLUX	BD Biosciences		Sistema de
microscopio de escaneo láser confocal Nikon A1R clasificador FACS conectado a un ECLIPSE Ti invertido	Nikon Corp.		Microscopio de barrido láser confocal
NIS-Elements AR.4.13.01 software de 64 bits	Nikon Corp.		Software NIS-Elements
Plan Apo VC 20x Objetivo DIC (NA: 0.75)	Nikon Corp.
Cámara termostatizada ECLIPSE Ti	Nikon Corp.		Cámara termostatizada
ImageJ	RBS
FlowJo	Tree Star, Ashland, OR
Ratones FUCCI	RIKEN BioResource Center, JAPÓN