Imágenes microendoscópicas de calcio en tiempo real en un ratón que se mueve libremente

Resumen

Fuente: Lee, H. et. al., Imágenes exitosas de calcio in vivo con un microscopio miniaturizado de montaje en la cabeza en la amígdala de un ratón que se comporta libremente. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra imágenes de calcio in vivo en un ratón utilizando un índice de refracción de gradiente, o lente GRIN, y un microscopio miniaturizado. La configuración combina la fijación de la cabeza dentro de un sistema de jaula móvil sin fricción, estimulando las neuronas y desencadenando la entrada de iones de calcio. La lente GRIN captura la señalización de calcio en el cerebro, lo que permite la visualización en tiempo real de la actividad neuronal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

NOTA: Este protocolo consta de seis pasos principales: cirugía de inyección de virus, cirugía de implante de lentes con índice de refracción en gradiente (GRIN), validación de la implantación de lentes GRIN, fijación de la placa base, registro óptico de la señal GCaMP (fusión de proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina (CaM) y M13, una secuencia peptídica de la quinasa de cadena ligera de miosina) durante una prueba de comportamiento y procesamiento de datos (Figura 1A). Excepto para la cirugía, se utiliza el paquete de software comercial (Inscopix).

1. Cirugía estereotáxica: inyección de virus adenoasociados (AAV<br />NOTA: La cepa de ratón utilizada en este procedimiento quirúrgico es C57BL6/J. El cuerpo del animal se cubre con un paño estéril durante la cirugía, y todos los pasos del protocolo se realizan con guantes estériles. Por lo general, no se realizan múltiples cirugías el mismo día. Sin embargo, si varios ratones tienen que someterse a la misma cirugía el mismo día, utilice un conjunto separado de herramientas quirúrgicas esterilizadas en autoclave para cada ratón y etanol al 70% para desinfectar los instrumentos quirúrgicos entre ratones. Para mantener al ratón caliente durante el procedimiento quirúrgico, el ratón se cubre con una manta quirúrgica hecha a medida después de fijarlo al marco estereotáxico.

1. Desinfecte todas las herramientas quirúrgicas necesarias con etanol al 70% y prepare una jeringa Hamilton y una pipeta de vidrio. Llene la pipeta de vidrio con agua destilada.
   NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas utilizadas en el protocolo se esterilizan en autoclave. Debido a que la lente GRIN y los tornillos de la calavera no se pueden esterilizar en autoclave para la esterilización, se utiliza etanol al 70% como desinfectante para prevenir la inflamación. Aunque no se ha probado, se pueden utilizar otras formas de esterilización, por ejemplo, la esterilización con gas o química.
2. Anestesiar al ratón con pentobarbital (83 mg∙kg-1 de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal. Después de que el ratón quede inconsciente, afeita el pelaje del cráneo.
3. Limpie la piel por encima del cráneo con etanol al 70% y fije el ratón al marco estereotáxico. Retire con cuidado la piel y limpie la superficie del cráneo con una solución de peróxido de hidrógeno al 35% con un aplicador de punta de algodón. Aplique ungüento lubricante para los ojos para evitar que la córnea se seque durante la cirugía.
   NOTA: Aunque generalmente no hay problema con el uso de etanol al 70% solo para la preparación aséptica de la piel, se recomienda usar 3 rondas alternas de desinfectante, por ejemplo, yodóforos o solución de clorhexidina, y etanol al 70%. Se utiliza una mayor concentración de peróxido de hidrógeno en este protocolo para asegurarse de que el tejido conectivo del cráneo del ratón se elimine lo más completamente posible, lo cual es fundamental para reducir los artefactos de movimiento durante las imágenes posteriores porque el tejido conectivo del cráneo interfiere con una unión firme de la placa base al cráneo. Hay que tener en cuenta que el peróxido de hidrógeno al 35% es mucho más alto de lo que se utiliza normalmente (3%).
4. Fije el pin con un soporte de sonda estereotáxica. Alinea la altura del bregma y lambda con el alfiler.
5. Encuentre la ubicación específica en el cráneo del ratón para la craneotomía.
   NOTA: Las coordenadas de la amígdala lateral (LA) para la inyección del virus son (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) de bregma en este protocolo (AP; Antero-Posterior, ML; Medial-Lateral, DV; Dorsal-Ventral, cada abreviatura indica distancia axial relativa desde el bregma). Las coordenadas deben optimizarse para cada condición experimental.
6. Taladre la superficie del cráneo (Figura 1B). Lave las fracciones del cráneo con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Retire la capa restante con unas pinzas o una aguja de 27 G.
   1. Al perforar el cráneo, trate de no tocar la última capa de la duramadre para evitar dañar la superficie del tejido cerebral. Una superficie cerebral dañada causa inflamación alrededor de la lente, lo que induce artefactos de movimiento severos y alta autofluorescencia durante la grabación. La craneotomía es de 1,6 mm. La velocidad de perforación es de 18.000 rpm y el tamaño de la broca es de 0,6 mm.
7. Para bajar la lente GRIN desde la superficie del tejido cerebral del sitio perforado hasta el sitio de la amígdala objetivo, calcule la distancia denominada "Valor A" restando la diferencia DV entre el bregma y la superficie cerebral expuesta de la coordenada DV de la implantación de la lente, que se establece en función del bregma (4,2 mm en este caso, Figura 1C).
8. Cargue 3 μL de aceite mineral y 0,7 μL de la solución de virus AAV en la pipeta de vidrio.
   NOTA: El aceite mineral ayuda a separar la solución de virus y el agua. 0,7 μL es un volumen optimizado para la inyección del virus LA que puede cubrir completamente la LA.
9. Retire la clavija del soporte de la sonda estereotáxica y fije la pipeta de vidrio a ella.
10. Localice la pipeta de vidrio en el lugar de inyección mencionado en el paso 1.5. Inserte la pipeta de vidrio en el tejido cerebral después de que el sangrado se detenga por completo.
11. Administre el virus a través de una pipeta de vidrio utilizando una bomba de inyección.
    NOTA: El título del virus debe ser superior a 1 x 1013 vg/mL para obtener un número suficiente de células que expresan GCaMP. La velocidad de inyección es de 0,1 μL/min y se difunde durante 10 min. Si hay sangrado, lave la superficie del cerebro con PBS. Mantenga la superficie del cerebro húmeda en este paso.
12. Después de finalizar la inyección, retire la pipeta de vidrio lentamente.

2. Cirugía estereotáxica: implante de lentes GRIN
NOTA: La cirugía de implante de lentes GRIN es el paso más crítico en este protocolo. Dado que una velocidad lenta y constante del movimiento de la lente GRIN es fundamental para el éxito de la implantación de la lente GRIN, puede ser útil un brazo de cirugía motorizado. El brazo de cirugía motorizada es un manipulador estereotáxico controlado por un software informático. Aunque en este protocolo se utiliza el brazo motorizado, también se pueden utilizar otras formas siempre que el cristalino se mueva de forma constante y lenta durante la implantación. La información detallada sobre el dispositivo se encuentra en la Tabla de Materiales.

1. Taladre el cráneo para implantar dos tornillos de cráneo. Lave todas las fracciones del cráneo con PBS.
   NOTA: Para reducir los artefactos de movimiento en imágenes ópticas posteriores, se requieren al menos dos tornillos. Los dos tornillos de cráneo y la posición del implante de lente GRIN forman un triángulo equilátero (Figura 1B). El tamaño de la craneotomía debe coincidir perfectamente con el diámetro del tornillo. Si hay sangrado, lave la superficie de sangrado con PBS. La velocidad de perforación es de 18.000 rpm y el tamaño de la broca es de 0,6 mm.
2. Desinfecte los tornillos con etanol al 70% para evitar la inflamación. Implante los tornillos lo más profundo posible.
   NOTA: Los tornillos deben fijarse firmemente sin adherencia adicional, como cemento.
3. Instale un brazo quirúrgico motorizado en el marco estereotáxico. Conecte el hardware requerido a la computadora portátil en la que está instalado el software de control (Tabla de materiales).
4. Antes de bajar la lente GRIN, prepárese para hacer una pista de aguja con una aguja de 26 G.
   NOTA: La pista de la aguja es una especie de pista guía que ayuda a implantar la lente GRIN relativamente gruesa en regiones cerebrales profundas, como la amígdala, sin causar una distorsión grave de la estructura cerebral a lo largo de la vía de inyección. Esta pista guía se denomina pista de aguja porque se realiza mediante un procedimiento de descenso y elevación de una aguja relativamente delgada de 26 G.
5. Coloque el soporte de la cánula para sujetar de forma estable la aguja en el marco estereotáxico.
6. Sujete la aguja de 26 G con el soporte de la cánula y calcule las coordenadas del sitio de inserción de la aguja.
   NOTA: En este protocolo, las coordenadas del sitio de inserción de la aguja son 50 μm laterales desde el sitio de inyección del virus (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm).
7. Acceda al software de control y complete la preparación para manipular la posición de la aguja.
   1. Ejecute el software de control y seleccione el botón Iniciar nuevo proyecto para iniciar la sesión de control.
      NOTA: En la sesión de control, hay varias cajas en blanco y botones de menú. Los cuadros en blanco son espacios de entrada para las coordenadas. Después de ingresar las coordenadas en los cuadros en blanco, el brazo estereotáxico motorizado se mueve haciendo clic en el botón Ir a. El botón Ir a cambia a un botón STOP cuando el brazo estereotáxico está en movimiento. Entre varios botones de menú, solo se requiere el botón Herramienta en este protocolo.
   2. Haga clic en el botón Herramienta. Calibra el software de control haciendo clic en el botón del menú Calibrar el marco. La calibración es el proceso mediante el cual la posición real del manipulador se establece como valores en el software Stereodrive.
8. Ubique la punta de la aguja en la superficie expuesta del cerebro en la superficie del cráneo utilizando un manipulador estereotáxico.
   NOTA: La velocidad de la aguja se establece utilizando el menú de velocidad de Microdrive en el menú de herramientas. La velocidad predeterminada es de 3,0 mm/s. Sin embargo, se recomienda una velocidad de 0,5 mm/s en este paso. El movimiento de la aguja se controla mediante las teclas de flecha.
9. Agregue 2-3 gotas de PBS para mantener húmeda la superficie del cerebro. Rellene el recuadro en blanco de la pantalla del ordenador con las coordenadas DV correspondientes del LA. Si la superficie del cerebro está seca, dificulta la penetración de la aguja en el tejido cerebral.
10. Baje la aguja de 26 g haciendo clic en el botón Ir a. Se detiene automáticamente cuando la aguja alcanza el sitio objetivo establecido por las coordenadas DV. La velocidad de la aguja es de 100 μm/min. Si hay sangrado, detenga la aguja haciendo clic en el botón STOP y lave la superficie del cerebro con PBS. Mantenga la superficie del cerebro húmeda en este paso. Después de detener el sangrado, comience a bajar de nuevo.
11. Después de que la aguja deje de moverse por completo, ingrese 45.00 mm en el cuadro en blanco en la pantalla de la computadora.
    NOTA: 45.00 mm es un valor de la coordenada DV que hace que la aguja regrese a la posición inicial.
12. Eleve la aguja haciendo clic en el botón Ir a. La velocidad de movimiento de la aguja es de 100-200 μm/min.
13. Después de que la aguja deje de moverse, retire el PBS de la superficie del cerebro. Desinstale el soporte de la aguja y la cánula del marco estereotáxico. El experimentador puede detener manualmente la aguja haciendo clic en el botón STOP cuando sea necesario.
14. Equipe la varilla estereotáxica con el soporte de la lente. Instale la lente GRIN en el soporte de la lente.
    NOTA: La lente GRIN optimizada para apuntar al LA (0,6 mm de diámetro, 7,3 mm de longitud) se utiliza en este protocolo. Si el soporte de la lente no está preparado, una forma alternativa es usar un clip bulldog para agarrar la lente GRIN.
15. Desinfecte la lente con etanol al 70% y fije la varilla estereotáxica a los marcos estereotáxicos.
16. Ubique la punta de la lente GRIN en el sitio designado en la superficie del cráneo (el mismo método descrito en el paso 2.8).
    NOTA: La coordenada de la lente GRIN es (AP, ML, DV) = (-1.6 mm, -3.55 mm, -4.2 mm) (Figura 1C). La lente no debe tocar el cráneo para evitar daños en la punta.
17. Calcule la coordenada DV restando el valor absoluto de "Valor A" de la coordenada DV de la implantación de la lente descrita en el paso 2.16.
18. Deje caer 2-3 gotas de PBS en la superficie del cerebro. Introduzca 1000 μm para bajar y 300 μm para subir la lente en el cuadro en blanco de la pantalla del ordenador.
19. Repita la bajada (1000 μm hacia abajo) y la subida (300 μm hacia arriba) de la lente GRIN hasta que llegue al sitio objetivo. Este procedimiento hacia arriba y hacia abajo se utiliza para ayudar a liberar la presión generada dentro del tejido cerebral debido al procedimiento de descenso del cristalino que, de lo contrario, puede causar distorsión de las estructuras cerebrales a lo largo de la vía de implantación.
    NOTA: La velocidad de movimiento de la lente GRIN es de 100 μm/min. Incluso si hay sangrado, no deje de mover la lente GRIN y lave la superficie del cerebro con PBS. Mantenga la superficie del cerebro húmeda en este paso. Si la superficie del cerebro está seca, el tejido cerebral se adhiere a la superficie del cristalino GRIN y causa distorsión de la estructura cerebral.
20. Si la lente GRIN alcanza el sitio objetivo, retire el PBS y aplique cuidadosamente el cemento dental de resina alrededor de la lente GRIN, los tornillos y su pared lateral (Figura 1D).
    NOTA: La aplicación del cemento de resina en todo el cráneo puede reducir los artefactos de movimiento. Por el contrario, si el cemento de resina cubre accidentalmente los músculos unidos al cráneo, aumenta los artefactos de movimiento.
21. Después de que el cemento dental de resina se endurezca, desmonte la lente GRIN del soporte de la lente y aplique cemento acrílico por todo el cráneo (Figura 1D).
22. Para colocar la placa de la cabeza, desmonte el soporte de la lente de la varilla estereotáxica y fije la placa de la cabeza en la punta de la varilla con cintas adhesivas. Confirme si la placa principal está horizontal.
    NOTA: Una placa principal inclinada provoca una vista inclinada. Se requiere una placa de cabeza para fijar la cabeza del ratón en el sistema de jaula de la casa móvil (en la sección de fijación de la placa base). Si el experimentador no utiliza el sistema, omita este paso (paso 2.22) y el siguiente paso 2.23.
23. Baje lentamente la varilla hasta que la placa de la cabeza se encuentre en la parte superior del manguito de la lente. Baje la placa principal 1000 μm más. Mueva la placa del cabezal de la lente GRIN implantada para ubicarla en el borde derecho del anillo interno de la placa del cabezal.
    NOTA: La placa del cabezal debe colocarse más abajo que la superficie de la lente GRIN implantada; de lo contrario, el microendoscopio no puede acercarse lo suficiente a la lente GRIN implantada para ajustar el plano focal debido al cemento acrílico.
24. Aplique cemento acrílico para unir la placa de cabeza a las capas de cemento (Figura 1D).
25. Coloque la película de parafina en la superficie de la lente GRIN implantada para proteger la superficie de la lente del polvo. A continuación, aplique una unión epoxi extraíble sobre la película de parafina para mantener la película de parafina en la superficie de la lente.
26. Inyecte la solución de carprofeno, un analgésico (0,5 mg/mL en PBS), y dexametasona, un fármaco antiinflamatorio (0,02 mg/mL en PBS), en la cavidad peritoneal del ratón.
    NOTA: La dosis del fármaco depende del peso corporal: Carprofeno (5 mg∙kg-1 de peso corporal) y dexametasona (0,2 mg∙kg-1 de peso corporal). Tanto el carprofeno como la dexametasona se administran después de la cirugía y una vez al día durante 7 días después de la cirugía.
27. Mezcle 0,3 mg/ml de amoxicilina, un antibiótico, en el agua de la jaula casera para administrar el medicamento durante 1 semana.
28. Regrese el ratón a la jaula de casa y espere de 5 a 8 semanas para la recuperación y la transducción del virus.
    NOTA: El ratón se recupera en una jaula precalentada sobre una manta eléctrica hasta que el ratón se despierta de la anestesia.

3. Validación de la implantación de la lente GRIN
NOTA: La validación de la implantación de la lente GRIN proporciona información sobre si la lente GRIN implantada está en el objetivo de las células que expresan GCaMP. Sobre la base de esta información, el experimentador ahorra tiempo en procesos que consumen mucho tiempo, como la prueba de comportamiento y el procesamiento de datos, al excluir a los animales con implante de lentes GRIN fuera del objetivo. Durante el procedimiento de validación, las celdas con expresión GCaMP deben centrarse en el campo de visión de la grabación. En este paso se utiliza una jaula de casa móvil. Una jaula de casa móvil es un aparato especializado de forma redonda que permite a los ratones con la cabeza fija mover libremente sus patas durante la validación de la implantación de la lente GRIN y la fijación de la placa base. Una mesa elevadora de aire en este aparato, en la que se colocan las patas de los ratones con la cabeza fija, permite este libre movimiento de las patas, aunque la cabeza esté fija. Las células del núcleo lateral de la amígdala suelen estar tranquilas en estado de reposo o anestesiadas, por lo que las señales de fluorescencia de GCaMP rara vez se detectan en estas condiciones, lo que hace muy difícil, a veces imposible, encontrar células que expresen GCaMP durante la validación de la implantación de la lente GRIN y la fijación de la placa base. Sin embargo, el movimiento de las patas a menudo produce señales de fluorescencia GCaMP en las células del núcleo lateral de la amígdala y, por lo tanto, puede ayudar a localizar el microscopio. Por lo tanto, la jaula de la casa móvil se utiliza en este protocolo.

1. Ensamble el manipulador estereotáxico en el sistema de jaulas de la casa móvil.
2. Anestesiar al ratón con gas isoflurano al 1,5%. Después de que el mouse esté completamente inconsciente, colóquelo en la barra principal del sistema de jaulas para casas móviles.
3. Localiza la jaula de carbono debajo del ratón. Cierre la jaula de carbono y encienda el flujo de aire para que la jaula se mueva libremente sin fricción. Espere unos minutos hasta que el ratón se active.
   NOTA: La velocidad del flujo de aire debe optimizarse para cada condición experimental (en este caso, 100 L/min).
4. Retire la película de parafina y la unión epoxi de la superficie de la lente GRIN implantada y limpie la superficie de la lente con etanol al 70% con papel para lentes.
5. Prepare el software de adquisición de datos (DAQ) (por ejemplo, Inscopix). Establezca las condiciones de imagen.
   NOTA: El software DAQ se utiliza para controlar el microscopio (potencia del diodo emisor de luz (LED), enfoque de la lente, etc.) y el almacenamiento de datos.
   1. Enciende la caja DAQ y conecta un microscopio a ella. Luego, conéctelo a una computadora portátil, ya sea directamente usando un cable o a través de Internet inalámbrico.
      NOTA: El software DAQ se instala en el hardware adicional llamado caja DAQ (por ejemplo, Inscopix). Al conectar la caja DAQ a la computadora portátil, el software DAQ se vuelve accesible en una computadora portátil.
   2. Acceda al software DAQ a través de un navegador de Internet (se recomienda Firefox).
   3. Establezca todos los detalles necesarios (fecha, ID del ratón, etc.) en la sesión definida. A continuación, haga clic en Guardar y continuar. Después de guardar, acceda a la sesión Ejecutar.
   4. En la sesión de ejecución, configure las condiciones de imagen, como el tiempo de exposición, la ganancia, el enfoque electrónico y la potencia del LED de exposición.
      NOTA: La ganancia y la potencia del LED de exposición pueden cambiar según las condiciones del laboratorio. El valor recomendado para el enfoque eléctrico es 500 y el tiempo de exposición es de 50 ms. No hay ninguna restricción para cambiar la potencia y la ganancia del LED. Sin embargo, una mayor intensidad de luz puede causar más blanqueamiento. El tiempo de exposición de la grabación determina la velocidad de fotogramas de la grabación de vídeo. Las velocidades de fotogramas más altas reducirán la intensidad de la señal. Las velocidades de fotogramas deben optimizarse para los GECI utilizados para la obtención de imágenes.
6. Para sujetar el microscopio en un manipulador estereotáxico, conecte la varilla estereotáxica con una pinza de microscopio al manipulador estereotáxico.
   NOTA: La pinza es un pequeño accesorio que se puede acoplar al aparato estereotáxico para sujetar el cuerpo de un microscopio y colocarlo en la ubicación del cerebro objetivo.
7. Sujete el microscopio con la pinza del microscopio. Encienda la luz LED conectada al microscopio y alinee el microscopio verticalmente. Baje el microscopio mientras observa la imagen hasta que aparezca la superficie de la lente GRIN implantada.
8. Alinee el centro de la lente GRIN implantada con el centro de la vista.
   NOTA: La validación de la implantación de la lente GRIN se puede realizar en este paso (mencionado en la sección de resultados, Figura 2B, Figura 2D, Figura 2F).
9. Capture la imagen de la superficie de la lente GRIN implantada (haga clic en el botón Prt Sc en el teclado). La imagen de la superficie de la lente GRIN implantada es necesaria para anular la selección de componentes no neuronales durante el procesamiento posterior de datos (paso 6.8).
10. Encuentre la posición adecuada del microscopio. Eleve lentamente la lente del objetivo del microscopio mientras observa la imagen para buscar células con expresión GCaMP7b.
    NOTA: Puede ser necesario ajustar la ganancia de la adquisición de la imagen o la potencia del LED de exposición. La validación de la implantación de la lente GRIN se puede llevar a cabo en este paso (mencionado en la sección de resultados, Figura 2A, Figura 2C, Figura 2E).

Resultados

Figura 1: Flujo de trabajo esquemático y diagramas para cirugía estereotáxica para imágenes microendoscópicas de calcio in vivo en la AI. (A) Un flujo de trabajo esquemático de imágenes microendoscópicas de calcio in vivo en la LA. (B) Una imagen microsc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
26G aguja	BD	302002	Cirugía
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	Cirugía
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	Cirugía
a medidaCemento acrílico-dental (Ortho-jet Acrylic Pink)	Lang	1334-pink	Cirugía y fijación de placa base
Manipulador de flujo de aire	Neurotar	NTR000253-04 Fijación de	la placa base
Amoxicilina	SIGMA	A8523-5G
Cirugía Jaula de carbono	Neurotar	180mm x 70mm	Fijación de la placa base
Carprofen	SIGMA	PHR1452-1G	cirugía
Software de procesamiento de datos	INSCOPIX	Software de procesamiento de datos INSCOPIX	Fijación de la placa base y prueba de comportamiento
Dexametasona	SIGMA	D1756-500MG	Fresa de cirugía
	Seyang	marathon-4	Fresa de cirugía
	ELA	US1/2, Shank104	Cirugía
Aguja de vidrio	WPI	PG10165-4	Cirugía
Lente GRIN (INSCOPIX Proview Lens Probe)	INSCOPIX	1050-002208
Cirugía Hamilton Jeringa Hamilton		84875	Cirugía
Placa de cabeza	Neurotar	Model 5	Cirugía
Ordenador portátil	Samsung	NT950XBV	Surgery
Soporte para lentes, Varilla estereotáxica (kit de implantes INSCOPIX proview)	INSCOPIX	1050-004223	pinza
microscopio	quirúrgico INSCOPIX	1050-002199 Fijación de	placa base
Microscopio, software DAQ, hardware	INSCOPIX	nVista 3.0	Fijación de placa base y prueba de comportamiento
homecage	Neurotar	MHC V5	Fijación de placa base
motizado	Neurostar	Cirugía personalizada
Software de brazo moteado	Neurostar		Cirugía personalizada
Adhesivo epoxi removible	WPI	Kwik-Cast	Cirugía
Cemento de resina (Super-bond)	Sun medical	Super bond C&B
Cirugía Tornillo de cráneo	Stoelting	51457	Cirugía
Marco estereotáxico	Stoelting	51600	Cirugía
Manipulador	estereotáxicoStoelting	51600	Fijación de placa base

para Mobil brazo