Visualización del plexo coroideo cerebral de un ratón mediante microscopía electrónica de barrido

Resumen

Fuente: Van Wonterghem, E., et al. Microdisección y visualización de microscopía electrónica de barrido de montaje completo del plexo coroideo de ratón. J. Vis. Exp. (2022)

Este video muestra la preparación y la obtención de imágenes del tejido del plexo coroideo del cerebro de un ratón utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM). El proceso incluye la fijación de tejidos, la deshidratación y el recubrimiento con una capa conductora de platino para estabilizar y preparar la muestra para la obtención de imágenes. La SEM captura imágenes detalladas de las células epiteliales con microvellosidades, lo que proporciona información sobre las características estructurales del tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Análisis morfológico del tejido del plexo coroideo (CP) mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)

PRECAUCIÓN: Se utilizan soluciones tóxicas en los siguientes pasos de procesamiento. Se recomienda realizar la preparación de la muestra en una campana extractora.

1. Realice la preparación de la muestra para SEM como se describe a continuación.
   1. Transfiera el CP fresco aislado a una solución de fijación recién hecha que contenga 2% de paraformaldehído y 2,5% de glutaraldehído en tampón de Na-cacodilato de 0,1 M (pH 7,4). Incubar durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Como el tejido CP es muy frágil y delgado, el tejido debe colocarse en pequeñas cestas de muestras (ver Tabla de Materiales) para transferirlo entre tampones. De esta manera, la estructura del tejido se conservará mejor. Se utiliza un fijador a base de cacodilato en lugar de uno a base de solución salina tamponada con fosfato (PBS), ya que el tampón de cacodilato fuerte puede contrarrestar el pH bajo del glutaraldehído en el fijador EM.
   2. Lave la muestra 3 veces durante 5 minutos cada una con 3-5 ml de tampón de Na-cacodilato de 0,1 M (pH 7,4).
   3. Fije las muestras en 3-5 mL de tetróxido de osmio al 2% en tampón de Na-cacodilato de 0,1 M durante 30 min. Lave las muestras 3 veces durante 5 min cada una con 3-5 mL de agua ultrapura.
   4. Deshidratar las muestras en una serie de soluciones heladas de concentraciones crecientes de etanol (EtOH) (50%, 70%, 85%, 100%), durante 15 min por solución de EtOH. Utilice un secador de puntos críticos para secar correctamente la muestra. NOTA: El cambio de fase líquida a gaseosa afecta la tensión superficial, causando daños a la estructura de la superficie. El paso de secado del punto crítico permite la preservación de la estructura de la superficie.
   5. Coloque la muestra con cuidado en un soporte de muestra provisto de una etiqueta de carbono (consulte la Tabla de materiales).
   6. Cubra las muestras con una capa delgada (2-5 nm) de platino. Para ello, monte una fuente de platino en un sistema de vacío entre dos terminales eléctricos de alta corriente y caliente el platino hasta su temperatura de evaporación. Un fino chorro de platino se deposita sobre la muestra. nota: Además del platino, también se puede utilizar oro u oro/paladio.
2. Visualice las muestras de CP con SEM (ver Tabla de Materiales). El procedimiento de visualización del tejido CP mediante SEM es similar al de otros tipos de tejidos y depende del software utilizado y de los instrumentos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soportes de probetas de aluminio	EM Sciences	75220
Tampón de cacodilato	EM Sciences	11652
Lengüetas adhesivas de carbono -12 mm	EM Sciences	77825-12
Secador de punto crítico	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss	Sistema SEM
	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldehído	EM Sciences	16220
Tetróxido de osmio	Sciences	19170
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS sin Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ o rojo fenol; filtrado estéril
Cesta de muestras de acero inoxidable	EM Sciences	70190-01

Pinzas EM