Imágenes de fluorescencia de la dinámica sináptica del calcio en un modelo in vitro de esclerosis lateral amiotrófica

Resumen

Fuente: Krishnamurthy, K. et al. Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra imágenes de calcio en tiempo real para monitorear la actividad sináptica en neuronas mutantes de ELA que expresan un biosensor de calcio codificado genéticamente. Describe los pasos para preparar las neuronas para la obtención de imágenes, estimular la dinámica del calcio y registrar la fluorescencia para medir los cambios en tiempo real en los niveles de calcio intracelular, que reflejan la actividad sináptica neuronal.

Protocolo

1. Imágenes de fluorescencia de transitorios de calcio Gcamp6m

1. Transfecte neuronas corticales primarias de roedores cultivadas en placas con fondo de vidrio de 35 mm con 500 ng de Gcamp6m.
   NOTA: Si lo desea, co-transfecte neuronas con un plásmido de interés que contenga una etiqueta fluorescente en el rango rojo o rojo lejano.
2. Incubar neuronas con líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) con bajo contenido de cloruro de potasio (KCl) (Tabla 1) durante 15 minutos y 48 h después de la transfección, y luego montar la placa en la plataforma de imágenes.
3. Visualice la fluorescencia de GCaMP6m utilizando un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (488 nm) y un objetivo de 20x o 40x.
4. Seleccione el campo de imagen y active el enfoque perfecto. A continuación, tome una sola imagen fija con canales de marcador de fluorescencia, FITC y campo claro para marcar los límites neuronales.
5. Inicie Ejecutar ahora en el software de adquisición. Llevar a cabo el registro basal durante 5 min y luego perfundir con un LCR que contenga 50 mM de KCL (Tabla 1).
   NOTA: El objetivo de esta imagen es medir los transitorios de calcio evocados. Si una neurona tiene actividad de disparo basal y flujos de calcio durante el período de preestimulación, no se utiliza en el análisis de datos. En su lugar, solo se utilizan células con fluorescencia de fondo estable. Los períodos posteriores a la estimulación también pueden extenderse a 60 minutos para los transitorios de calcio, con o sin perfusión continua adicional de KCl alto.
6. Guarde el experimento y analice los datos con software confocal. El experimento puede detenerse en este punto, y el análisis puede realizarse más tarde.
   NOTA: Si las células no requieren transfección para la expresión de proteínas de interés, este protocolo puede realizarse en cualquier momento in vitro cuando se busca examinar los transitorios de calcio. Después de una prueba de células de control para asegurar la medición de los transitorios de calcio, el experimentador debe ser ciego a las condiciones genéticas o farmacológicas de cada placa probada para minimizar el sesgo.

2. Análisis de imágenes

1. Abre imágenes time-lapse con software confocal.
2. Alinear imágenes en series de lapso de tiempo mediante la serie de comandos: Imagen | Procesamiento | Alinear el documento actual. Seleccione Alinear con el primer fotograma.
3. Seleccione regiones de interés (ROI) a lo largo de las neuritas utilizando la herramienta de selección de ROI, un icono en forma de frijol a la derecha del marco de la imagen. Además, marque un ROI que represente la intensidad de fluorescencia de fondo.
   NOTA: Los ROI se seleccionan eligiendo áreas de puntos claramente separados a lo largo de las pistas neuronales indicadas por la imagen fija de campo claro. Se eligen al menos cinco ROI por neurona para el análisis. El ROI de fondo se elige en una región del campo de visión que no contenga neuritas.
4. Mida la fluorescencia bruta a lo largo del tiempo para los ROI seleccionados utilizando la siguiente serie de comandos: Medir | Medición del tiempo.
   1. Inicia la función Medir en la parte superior del panel de Medición de Tiempo. Se genera una representación gráfica de la fluorescencia bruta a lo largo del tiempo y datos cuantitativos.
      NOTA: Cada punto de datos representa la fluorescencia bruta para ese ROI para el marco asociado con ese punto de tiempo medido específico.
5. Exporte las intensidades de fluorescencia bruta al software de la hoja de cálculo.

Tabla 1: Composición de los tampones de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa).

Tampón aCSF de bajo KCL (pH 7,40 a 7,45)
Concentración	reactivos
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
Glucosa	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM
Alto KCL tampón aCSF (pH 7,40 a 7,45)
Concentración	reactivo
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50 mM
Glucosa	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM

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