Microscopía holográfica de dos fotones para estudiar la actividad neuronal y la conectividad en un modelo de ratón

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Implante de la placa cefálica (Figura 1A)

1. Administrar el anestésico (una mezcla de 74 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina) por vía intraperitoneal para anestesiar al ratón. Compruebe el estado anestésico del ratón con frecuencia evaluando los reflejos del pedal.
2. Después de la anestesia, coloque el ratón en un instrumento estereotáxico. Aplique un ungüento para los ojos (consulte la tabla de materiales) para evitar que la córnea se seque cuando se implante la placa de la cabeza.
3. Afeitar el área quirúrgica y desinfectar la piel con tres rondas alternas de exfoliantes de povidona yodada o clorhexidina seguidas de toallitas con alcohol al 70%. Exponga cuidadosamente el cráneo y límpielo con hisopos de algodón.
   NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos deben estar esterilizados y todos los procedimientos deben realizarse en consecuencia. Cualquier residuo restante (por ejemplo, cabello o sangre seca) causa reacciones inflamatorias. Por lo tanto, cualquier residuo debe eliminarse bajo un estereoscopio utilizando hisopos de algodón humedecidos con agua estéril o alcohol al 70%.
4. Utilice las coordenadas estereotácticas (anterior y posterior = 0,5 mm, medial y lateral = 1,5 mm de bregma) para encontrar el centro de la craneotomía y etiquetarla con un rotulador.
5. Coloque una placa de cabeza hecha a medida en el centro del cráneo. A continuación, aplique cemento dental (ver Tabla de Materiales) para fijarlo firmemente al cráneo. Aplique una ligera presión hasta que la placa de la cabeza haga contacto firme con la parte delantera y posterior del cráneo.
   NOTA: Este paso tarda aproximadamente 20 minutos en completarse y es fundamental para reducir los artefactos de movimiento en el cerebro durante la obtención de imágenes de dos fotones. Las dimensiones de la placa principal son de 20 mm × 40 mm × 1 mm con una abertura en forma de placa de inicio con un borde de 15 mm de largo, dos lados adyacentes de 3 mm de largo y los dos lados restantes de 10 mm de largo.
6. Mezcle un cemento de resina adhesiva dental a base de acrílico de la siguiente manera: media cucharada de polvo, tres gotas de líquido y una gota de catalizador (consulte la tabla de materiales). Para evitar que se seque, aplique este cemento de resina adhesiva dental mixto a la superficie intacta del cráneo del ratón con la placa de la cabeza.
7. Coloque al ratón en una jaula caliente hasta que se haya recuperado de la anestesia. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.

2. Cirugía e inyección de virus adenoasociados (AAV) (Figura 1B)

1. Realice una craneotomía o inyección viral sin retirar el cemento de resina adhesiva dental del cráneo 1 día después de la implantación de la placa de la cabeza.
   NOTA: Administre anestesia (una mezcla de 74 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina) por vía intraperitoneal al ratón durante este procedimiento.
2. Para evitar edema cerebral, administrar dexametasona fosfato sódico (1,32 mg/kg) por vía intraperitoneal 1 h antes de la cirugía.
3. Anestesiar el ratón con la placa de la cabeza con anestesia de isoflurano al 1% utilizando un vaporizador (sistema de administración de anestesia) mientras se mantiene la temperatura corporal con una almohadilla térmica. Aplique un ungüento para los ojos para prevenir la sequedad de la córnea.
4. Bajo un estereoscopio, realice una craneotomía circular de aproximadamente 2 mm de diámetro utilizando un taladro dental. Para reducir el daño cerebral, opere el taladro dental con cuidado con un ligero movimiento constante y una ligera presión hacia abajo.
5. Retire los fragmentos de hueso varias veces con un sistema de succión. Después de extraer los fragmentos óseos, use una solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, por sus siglas en inglés) para eliminar y lavar cualquier residuo que quede en la superficie del cerebro. Repita este procedimiento de limpieza varias veces para suprimir las reacciones inflamatorias.
   NOTA: La solución de ACSF (cloruro de sodio 140 mM, NaCl, cloruro de potasio 2,5 mM, KCl, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico, HEPES, cloruro de calcio 2,0 mM, CaCl₂ y cloruro de magnesio 1,0 mM, MgCl₂) se almacenó a 4 °C durante 1 mes después de que el reactivo se disolvió y filtró (tamaño de poro = 0,22 μm).
6. Usando un sistema de inyección a presión (ver Tabla de Materiales), ajuste la presión apropiada (alrededor de 10 libras por pulgada cuadrada (PSI) en pulsos con una duración de 4 ms) para inyectar 500 nL de solución de AAV a través de un capilar de vidrio con un diámetro de punta de 10-20 μm (preparado con un extractor de micropipetas) durante 10 min.
7. Determine si la solución de AAV se está administrando al cerebro comprobando si el nivel de la solución de AAV en el capilar de vidrio disminuye gradualmente.
8. Deje el capilar de vidrio en su lugar durante 10 minutos más para evitar el reflujo. Repita tres veces para administrar un total de 1,5 μL de solución de AAV en el cerebro.
9. Para evaluar y manipular la actividad neuronal en células piramidales de capa 2/3 (L2/3), inyecte una solución de AAV (para imágenes de Ca²⁺: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE a 1,28 ×^{10 14} genomas vectoriales/mL, diluido 1:1 en solución salina; para imágenes de Ca²⁺ con optogenética: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE a 1,73 × 10¹⁴ genomas vectoriales/mL, diluido 1:1 en solución salina) en el área de la pata trasera de la corteza somatosensorial primaria de ratones de tipo salvaje (S1, centrado a 0,5 mm posterior y 1,5 mm lateral del bregma, a 150 μm de profundidad desde la superficie).
   NOTA: La solución de AAV debe inyectarse a las 2-3 semanas y 1-2 semanas antes de la obtención de imágenes para la expresión de jGCaMP8f y GCaMP6m-P2A-ChRmine, respectivamente.
10. Después de una aplicación de agarosa de bajo punto de fusión al 2% (p/v) en la superficie cerebral de S1 utilizando una micropipeta, coloque una ventana de vidrio sobre la craneotomía con dos cubreobjetos. Fije los dos cubreobjetos (pequeño de 2,0 mm de diámetro y grande de 4,5 mm de diámetro; consulte la tabla de materiales) con adhesivo curable ultravioleta (UV).
11. Presione el cubreobjetos contra la agarosa mientras aún está líquida, esto evita la formación de burbujas de aire en la agarosa. Selle los bordes de la ventana craneal con cemento de resina dental y adhesivo (Figura 1C).
12. Retire el ratón del instrumento estereotáxico y devuélvalo a su jaula. Coloque al ratón en una jaula caliente y no regrese a la jaula con otros animales hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia. Mantenga cuidadosamente las condiciones estériles durante la cirugía de supervivencia.
13. Durante las primeras 72 horas después de la cirugía, verifique el estado de salud del ratón observando el comportamiento general. Si hay alguna anormalidad en el comportamiento general, inyecte por vía subcutánea agentes antiinflamatorios y analgésicos.

3. Preparación para el sistema de estimulación o iluminación holográfica (Figura 2)Calibre

1. el sistema de estimulación holográfica colocando la superficie de un portaobjetos de fluorescencia roja (sustrato acrílico fundido) en el plano de la muestra. Coloque el microscopio en modo de imagen en vivo con una luz de excitación débil y ejecute el archivo calibration_GUI.m. Compruebe el panel de parámetros y haga clic en el botón Guardar.
2. Haga clic en el botón Z Scan en el panel del paso 1. Generará automáticamente tres puntos aleatorios en los 21 planos axiales, separados por 2 μm de cada plano.
3. Mueva la barra deslizante y verifique la imagen en vivo. Encuentre un plano perfecto en el que las manchas parezcan más pequeñas y más brillantes, y luego haga clic en el botón Guardar. Esto generará automáticamente un frente de onda esférico desplazado para el holograma digital.
   NOTA: Si no encuentra los puntos de fluorescencia más brillantes, cambie los valores mínimo y máximo del rango de exploración y vuelva a intentarlo.
4. Haga clic en el botón Ir en el panel del paso 2 y, a continuación, haga clic en seis puntos en el cuadrado de la izquierda. Revisa la imagen en vivo. Si hay seis puntos de fluorescencia distinguibles, escriba sus ejes x e y en los cuadros de edición y haga clic en el botón Guardar. Esto generará automáticamente coeficientes de transformación afín para coordinar la calibración entre la estimulación holográfica y el sistema de imágenes.
   NOTA: El número de par de ejes y el número de punto en el que se hizo clic deben coincidir en orden. Si no está seguro, o si no hay puntos en su imagen, vuelva a intentarlo y genere un patrón de puntos único o elija un rango más pequeño alrededor del centro del campo de visión (FOV).
5. Haga clic en el botón Escanear en el panel del paso 3. Generará 441 hologramas digitales para realizar un escaneo de un solo punto a través del campo de visión en 21 × 21 pasos.
   1. Primero, revisa las imágenes mientras cambias los patrones en el cuadro de lista. A continuación, ajuste la potencia del láser para obtener imágenes puntuales dentro del rango dinámico del dispositivo de imagen (por ejemplo, para evitar imágenes demasiado saturadas).
   2. Posteriormente, ajuste el tiempo de intervalo en el cuadro de edición; el tiempo de intervalo debe ser más de dos veces el tiempo de intervalo de grabación. Finalmente, ponga el dispositivo de imagen en modo de grabación y haga clic en el botón Reproducir. Si la reproducción se completa, se mostrarán las cadenas "display OK" en la ventana de comandos. Detenga la grabación y apile las imágenes secuenciales grabadas utilizando el método de máxima intensidad.
6. Haga clic en Generar WM en el panel del paso 4 y elija una imagen apilada desde arriba. A continuación, cierre la ventana de calibration_GUI. Generará automáticamente un mapa de peso para compensar la intensidad desequilibrada en cada punto.
   NOTA: Para una descripción más detallada, el código de MATLAB se puede descargar desde aquí (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Obtención de imágenes de Ca²⁺ utilizando un sensor de imagen con iluminación holográfica (Figura 3)Coloque

1. el ratón inyectado en AAV con una placa de cabeza bajo el microscopio (Figura 1D).
   NOTA: Durante este procedimiento, el ratón está restringido en el estado de vigilia, pero es capaz de escapar de estímulos incómodos.
2. Realice imágenes de dos fotones (modo de escaneo puntual) utilizando un microscopio holográfico y un láser de Ti: zafiro de modo bloqueado sintonizado a 920 nm con un objetivo de 25x (consulte la Tabla de materiales).
3. Encienda el software de imágenes comerciales (consulte la Tabla de materiales). En el modo de imagen en vivo, ajuste el voltaje del detector de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y la potencia del láser de imágenes para optimizar el brillo de las neuronas que expresan jGCaMP8f. Captura imágenes de las neuronas que expresan esta proteína.
   NOTA: La intensidad del láser de imagen (920 nm) es de 20-30 mW. El campo de visión fue de 512 μm × 512 μm a una profundidad de 100-150 μm de la superficie cortical.
4. Para iluminar neuronas específicas que expresan jGCaMP8f con iluminación holográfica, ejecute el archivo de script SLMcontrol.m. Haga clic en la imagen de referencia y elija la imagen adquirida anteriormente. A continuación, haga clic en el botón Puntual para elegir píxeles específicos de las neuronas de la imagen haciendo clic continuamente con el ratón (Figura 3A). Si la selección está completa, presione el botón Enter en el teclado para finalizarla.
   NOTA: El holograma digital se calcula automáticamente y se muestra en el modulador de luz espacial (SLM). Este patrón también se puede volver a visitar haciendo clic en un cuadro de lista. La resolución espacial de un solo punto generado por el SLM fue de aproximadamente 1,2 μm a lo largo de la dirección transversal y de ~8,3 μm a lo largo del eje óptico. Utilizamos una lente de objetivo de alta apertura numérica (1.1) para lograr una estimulación holográfica más localizada.
5. Para detectar la actividad neuronal con alta resolución temporal utilizando un sensor de imagen (consulte la Tabla de materiales), configure el tiempo de exposición, el área de imagen y el agrupamiento (Figura 3B) antes de realizar la adquisición de imágenes (Figura 3C).
   NOTA: La intensidad del láser de iluminación holográfica (920 nm) que estimula continuamente una neurona es de 2 mW, lo que es suficiente para detectar la actividad neuronal. Por ejemplo, para lograr una velocidad de fotogramas de 100 Hz para la creación de imágenes, el tiempo de exposición es de 9 ms, el área de imagen es de 400 μm × 400 μm y la agrupación es de 4.
6. Después del experimento, regresa el ratón a su jaula de origen.

5. Imágenes de dos fotones (modo de escaneo puntual) con optogenética utilizando un microscopio holográfico (Figura 4)

1. Repita los pasos 4.1 y 4.2.
2. Encienda el software de imágenes comerciales (consulte la Tabla de materiales). En el modo de imagen en vivo, ajuste el voltaje del detector de imágenes (consulte la Tabla de materiales) y la potencia del láser de imágenes para optimizar el brillo de las neuronas que expresan GCaMP6m-P2A-ChRmine. Captura de imágenes de las neuronas que expresan estas proteínas (Figura 1E).
3. Repita el paso 4.4.
4. Para investigar la conectividad funcional dentro de las neuronas L2/3, utilice un SLM para generar patrones holográficos de estimulación optogenética (ChRmine; 1.040 nm) y combínelo con imágenes de dos fotones Ca²⁺ (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 píxeles, 2 Hz o 30 Hz, zoom digital 2x, modo de escaneo de puntos; Figura 3D-H).
   1. Para este protocolo, establezca la intensidad del láser de imagen en 920 nm, a 10-20 mW, y el FOV como 256 μm × 256 μm medido a una profundidad de 100-150 μm desde la superficie cortical. Establezca el tiempo de permanencia de píxeles en 1,5 μs para 2 Hz o 100 ns para 30 Hz.
   2. Para ver si un solo estímulo holográfico causó una respuesta de calcio en las neuronas, use 2 Hz y 30 Hz como velocidad de fotogramas de imagen. Establezca la intensidad del láser de estimulación holográfica (1.040 nm) que estimula una sola neurona a 10 mW, lo que es suficiente para inducir la actividad neuronal (Figura 3D).
      NOTA: La resolución espacial de un solo punto generado por el SLM es de aproximadamente 1,2 μm a lo largo de la dirección transversal y ~8,3 μm a lo largo del eje óptico. El rango de volumen accesible en la dirección lateral es de alrededor de 500 μm × 500 μm y 100 μm en la dirección axial. Hemos confirmado aún más con imágenes de Ca²⁺ a una velocidad de fotogramas de imagen de 2 Hz o 30 Hz que no solo una neurona, sino varias neuronas pueden ser estimuladas holográficamente simultáneamente (Figura 3E).
5. Realice la adquisición de imágenes con el siguiente protocolo: obtenga imágenes simultáneas de la respuesta de Ca²⁺ a 920 nm con 10 estímulos holográficos a 1.040 nm con intervalos de 8 s (0,125 Hz) durante una duración de 50 ms después de un período de referencia de 10 s.

Figura 1: Esquema esquemático del procedimiento experimental. (A) Fijación de la placa de la cabeza al cráneo. (B) Inyección estereotáctica de AAV en el área de la pata trasera de la corteza somatosensorial primaria (S1HL). (C) Implantación de la ventana craneal. Para evaluar y manipular la actividad neuronal, se realizan imágenes in vivo de Ca2+ en ratones despiertos (D) con estimulación holográfica (E). Las marcas de destello indican estimulación holográfica o iluminación.

Figura 2: Diagrama de flujo de cómo calibrar el sistema holográfico de estimulación o iluminación. Este diagrama de flujo describe los pasos para calibrar un sistema holográfico de estimulación o iluminación para el espacio de muestra y el sistema de imágenes. Visite el paso 3, preparación para el sistema de estimulación o iluminación holográfica, para obtener instrucciones detalladas y descargar un programa de muestra.

Figura 3: Resultados representativos de la conectividad funcional y de imágenes utilizando un microscopio holográfico. (A) Para iluminar neuronas específicas que expresan jGCaMP8f o GCaMP6m-P2A-ChRmine, se captura la imagen de las neuronas y, a continuación, se forma un punto en la neurona utilizando un script de MATLAB personalizado. (B) La configuración del sensor de imagen (tiempo de exposición, área de imagen y agrupación). (C) Imagen representativa y rastros de neuronas que expresan jGCaMP8f en imágenes de 100 Hz con iluminación holográfica y un sensor de imagen. (D) Este gráfico muestra la respuesta neuronal a la estimulación holográfica (1.040 nm) a cada potencia láser (datos de GCaMP6m-P2A-ChRmine que expresan neuronas a una velocidad de fotogramas de imagen de 2 Hz [n = 16]). Las barras de error indican el error estándar de la media. (E) Trazas representativas de Ca2+ durante la estimulación holográfica (líneas verticales azules) de 10 neuronas diferentes a velocidades de fotogramas de imagen de 2 Hz (izquierda) y 30 Hz (derecha). En las trazas de 2 Hz y 30 Hz Ca2+, el mismo color indica la misma neurona. (F) Diagrama esquemático que evalúa las conexiones funcionales entre neuronas. Cuando se estimula la neurona naranja, las neuronas rojas responden al mismo tiempo, lo que indica que hay conectividad funcional entre estas neuronas. (G) Una imagen típica de neuronas S1HL que expresan GCaMP6m en tipo salvaje (WT). Barra de escala = 10 μm. (H) Trazas típicas de Ca2+ durante la estimulación holográfica (líneas verticales azules) a velocidades de fotogramas de imagen de 2 Hz (superior) y 30 Hz (inferiores). La neurona estimulada está encerrada en un círculo naranja, las neuronas que responden están rodeadas en rojo y las neuronas que no responden están rodeadas en gris. La capacidad de respuesta neuronal a la estimulación holográfica se puede detectar a velocidades de imagen de 2 Hz y 30 Hz.

Figura 4: Sistema utilizado para el microscopio holográfico. (A) Imágenes de las trayectorias de luz de estimulación e iluminación holográficas (izquierda) cerca del microscopio (centro) con un sensor de imagen (derecha). (B) Se trata de imágenes ampliadas de las trayectorias de luz de estimulación e iluminación holográficas alrededor de los respectivos SLM (izquierda y derecha) y una trayectoria de luz de barrido puntual alrededor de un cabezal de exploración (centro y derecha). (C) Un esquema de las trayectorias ópticas de estimulación e imagen. Los SLM de solo fase se utilizan para mostrar hologramas digitales, y un expansor de haz (una combinación de L1 y L2) y un sistema de relé 4f (una combinación de L3 y L4 para la estimulación holográfica y L4 y L5 para la iluminación holográfica) se colocan antes y después de los respectivos SLM para asegurarse de que cada holograma digital se visualice en la pupila de salida de una lente de objetivo de inmersión en agua. con un tamaño de imagen ligeramente infralleno. Para suprimir los componentes residuales de orden cero, se coloca un bloque de viga en el plano intermedio.