Imágenes de calcio en tiempo real de la corteza prefrontal medial de un ratón utilizando un miniscopio

Resumen

Fuente: Thapa, R., et. al., Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio en el cerebro profundo In Vivo. J. Vis. Exp. (2021)

El video muestra imágenes de calcio en tiempo real utilizando un miniscopio en un ratón transducido, correlacionando la actividad neuronal con el comportamiento.

Protocolo

Montaje del miniscopio e imágenes in vivo Ca²⁺ (Figura 1)

1. Monte el miniscopio en su base
   1. Anestesiar brevemente al ratón en la cámara de inducción (5% de isoflurano y 1 L/min de flujo de oxígeno). Coloque el ratón sobre una superficie de banco limpia.
   2. Afloje el tornillo de bloqueo con un destornillador pequeño, retire la tapa protectora y limpie la superficie de la lente GRIN (lente de índice degradado) con un hisopo de algodón empapado en acetona.
   3. Envuelva firmemente la rosca del miniscopio con cinta de PTFE (cinta de politetrafluoroetileno) y fíjelo a su base en la cabeza del ratón.
   4. Conecte el miniscopio al cable (Figura 2K) y encienda el software NeuView.
   5. En NeuView, haga clic en Hardware, marque LED1 y haga clic en el botón Stream para ver las imágenes en vivo (Figura 3A).
   6. Identifique el mejor plano focal ajustando la posición del miniscopio en relación con la base, ya sea apretando o aflojando ligeramente con la ayuda de pinzas romas.
      NOTA: El mejor plano focal se determina comparando varias ubicaciones posibles y seleccionando la que tenga una visualización clara de la mayoría de los cuerpos celulares.
   7. Apriete el tornillo de bloqueo y vuelva a colocar el ratón en su jaula de inicio.
   8. En NeuView, ajuste la potencia de la luz LED al nivel óptimo. Haga clic en los botones Capturar y luego en Disparar para comenzar a grabar y presione Detener después de 150 fotogramas.
      NOTA: La potencia más baja posible determina el nivel óptimo de potencia del LED para lograr una imagen lo suficientemente brillante. El propósito de grabar un video corto es facilitar la identificación del mismo plano focal en el futuro para imágenes repetitivas.
   9. Desconecte el cable del miniscopio. Deje que el ratón se recupere durante al menos 30 minutos antes de comenzar el experimento.
      NOTA: Para proteger el miniscopio, por lo general, la botella de agua y el alimentador de alimentos de alambre se retiran durante este corto período de tiempo. Si el ratón necesita permanecer en su jaula doméstica durante más tiempo, se recomienda suministrar gel dietético disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en la jaula doméstica.
2. Adquisición de datos para imágenes de calcio in vivo
   NOTA: En vivo, las imágenes de calcio se pueden realizar simultáneamente junto con cualquier prueba de comportamiento que el investigador desee. Con fines de demostración, el ejemplo aquí es la imagen in vivo de Ca²⁺ durante una prueba de campo abierto. Para lograr este objetivo, se requieren dos computadoras. Una computadora está equipada con software comercial (ver Tabla de Materiales) para controlar una cámara y registrar automáticamente el comportamiento del mouse. El otro ordenador está equipado con NeuView para controlar el miniscopio y grabar las imágenes de Ca²⁺.
   1. Enciende el software de la cámara de comportamiento (ver Tabla de Materiales) para ver la arena de comportamiento del ratón a través de una función Livestream. Ajuste manualmente el enfoque de la cámara superior (Figura 2L).
   2. Seleccione Trigger/Strobe y marque "Enable/disable trigger" (Figura 3B). Haga clic en el botón Grabar, use Examinar para seleccionar la ubicación donde se guardarán las grabaciones de comportamiento y seleccione el formato de imagen deseado.
      NOTA: La función "Control de activación" está habilitada para permitir que el registro de comportamiento sea activado por el software NeuView para que los marcos de comportamiento y los marcos de imagen de calcio correspondientes se acoplen temporalmente. El registro del comportamiento se puede guardar en cualquier formato deseado. El registro de comportamiento generalmente se guarda en formato JPEG en la carpeta designada.
   3. Acerque el ratón a la arena y conecte el miniscopio al cable conectado al sistema de adquisición de datos (Figura 2L) (consulte la tabla de materiales). A continuación, el ratón se coloca en el centro de la arena.
   4. Con la función Livestream del software NeuView, ajuste la potencia del LED para optimizar el brillo de la imagen de calcio.
      NOTA: Para las imágenes de calcio, la velocidad de fotogramas de grabación es de 10 fotogramas/s de forma predeterminada.
   5. En NeuView, desmarque LED1, haga clic en Capturar y luego en los botones Activar para comenzar a grabar y presione Detener después de 100 fotogramas.
      NOTA: Esto es para grabar imágenes de fondo durante unos 100 fotogramas con las luces LED apagadas.
   6. En el software de la cámara de comportamiento, haga clic en Iniciar grabación (Figura 3C). En NeuView, marque LED1, haga clic en Capturar y luego en los botones Trigger para comenzar a grabar. Presione Stop después de 3000 fotogramas.
      NOTA: Esto es para registrar imágenes y comportamiento de calcio simultáneamente. La prueba de campo abierto dura 15 minutos, normalmente dividida en tres sesiones de grabación de 5 minutos cada una. Esto es para evitar que el miniscopio se sobrecaliente debido al uso continuo.
   7. Guarde las imágenes de calcio y los registros de comportamiento en las carpetas designadas. Repita la grabación durante dos sesiones más mientras graba el fondo antes de cada sesión y guarde todas las grabaciones en la carpeta designada.

Resultados

Figura 1: Resumen esquemático del procedimiento experimental. (A) Inyección estereotáxica de virus en la mPFC (corteza prefrontal medial). (B) Implantación de lentes GRIN (lentes de índice degradado) en el CPF...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetona	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN limpiador de lentes Software
recodificación de comportamiento (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	Para registrar el comportamiento
Adquisición de datos controlador	NIDA/IRP	Componente de diseño	del sistema de adquisición de
imágenes cable de transmisión de datos	NIDA/IRP	Componente de diseño personalizado	del sistema de adquisición de imágenes
Lente GRIN	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	Para implantación de lentes GRIN
Base de miniscopio	Protolabs Diseñado	medida	Para el montaje de la base
Miniscopio brazo de sujeción	NIDA/IRP	Diseñado	a medida Para el montaje de la base
Tapa de protección del miniscopio	Protolabs	Diseñado a medida	Para la protección del miniscopio
Controlador motorizado	Thorlabs KMTS50E		Para el montaje de la base
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	Para la obtención de imágenes in vivo
Pomada oftálmica	Puralube Vet Pomada	NDC 17033-211-38	oftálmica
politetrafluoroetileno (PTFE)	TegaSeal Cinta de PTFE	A-A-58092	Para la fijación de miniScope a la base
Bastoncillo de algodón estéril	Puritan	REF 806-WC	Para ambas cirugías

de personalizado a Cinta de