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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Configuración del microscopio para imágenes de lapso de tiempo
1. Determinación de la configuración del láser
1. Determinación de la longitud de onda del láser a utilizar. Utilice una longitud de onda que sea el doble de la longitud de onda de excitación del fluoróforo de interés (por ejemplo, longitud de onda entre 880 y 940 nm para la proteína verde fluorescente (GFP).
NOTA: En el presente estudio, el ajuste de longitud de onda para GFP estaba entre 880 y 940 nm. Cuanto mayor sea la longitud de onda, menor será la potencia de salida del láser.
2. Determine la transmisión láser. Un alto porcentaje de transmisión láser matará al embrión, use el nivel más bajo de transmisión (recomendado). Para estudios de lapso de tiempo de 24 a 48 h, como se presenta en este documento, mantenga la transmisión por debajo del 5%.
3. Determine los sistemas de detección del microscopio y asegúrese de que los filtros correctos para el fluoróforo estén en su lugar.
NOTA: Para los microscopios multifotónicos, existen múltiples sistemas de detección con varias sensibilidades para la fluorescencia emitida. En general, un sistema de detección interno tiene menos sensibilidad que un sistema de detección externo. Para líneas transgénicas con altos niveles de expresión de GFP, el sistema de detección interna es adecuado. En el caso de líneas transgénicas con bajos niveles de expresión de GFP o con otros fluoróforos (por ejemplo, proteína fluorescente roja), puede ser necesario un sistema de detección externo para mantener el porcentaje de transmisión del láser a un nivel razonable. Independientemente del sistema de detección utilizado, se deben colocar los filtros correctos para el fluoróforo.
2. Ajustando la configuración del software en el microscopio multifotónico
1. Usando el objetivo 5X, localiza el embrión. Eleve manualmente la platina a la posición más alta y utilice el enfoque fino para colocar el embrión en el centro del rango del microscopio.
2. Baje manualmente la etapa y cambie el objetivo de 5X al objetivo de inmersión en agua de 25X (apertura numérica NA, 0.95). Levante con cuidado la etapa para volver a enfocar el embrión.
3. En el software, haga clic en el modo "xyzt" para obtener múltiples imágenes a intervalos de tiempo (t) en el plano x-y sobre una profundidad de "z". Utilice la epifluorescencia o la vista de campo claro para encontrar la profundidad de enfoque en el área de interés, lo que demarcará la pila Z.
1. En el software, haga clic en el botón "comenzar"; para estos experimentos, el borde lateral del ojo era el comienzo de la pila Z. Haga clic en el botón "finalizar"; la línea media del embrión era el final de la pila Z.
NOTA: El tamaño del paso era de 0,3-0,6 μm y había un total de ~200 pasos para un tamaño de pila z de 60 a 120 μm).
4. Haga clic en el menú para ajustar el tiempo de adquisición y la frecuencia de imagen.
Para el sistema actual, ~200 pasos requieren aproximadamente 5 minutos para cada adquisición de z-stack. Para una recuperación adecuada del fluoróforo y la supervivencia del embrión, permita una relación de al menos 1:3 entre la adquisición de la pila z (encendido del láser) y el tiempo de recuperación (apagado del láser).
NOTA: Por ejemplo, las pilas z se adquieren cada 20 minutos con 5 minutos de adquisición de pila z y 15 minutos de recuperación. Para este protocolo, se pueden obtener pilas z más grandes, pero aumentarían adecuadamente el tiempo entre las adquisiciones de pilas z, lo que resultaría en menos imágenes durante el curso de lapso de tiempo.
1. Con el tiempo adecuado para la recuperación del embrión, establezca el tiempo entre las pilas z en la ventana designada. Establezca la duración total del experimento en la ventana adecuada.
5. Ajustes finales de software, láser y embriones.
1. Activa la configuración de imagen en vivo para realizar los ajustes finales en la configuración del láser. Ajuste la transmisión láser, la ganancia y las barras deslizantes de compensación dentro del software para optimizar la imagen fluorescente. Además, ajuste la orientación del embrión, según sea necesario, en función de la duración del experimento, el crecimiento previsto del embrión, etc. Asegúrese de que el área de interés permanezca dentro del encuadre durante todo el experimento.
2. Apague la fuente de luz epifluorescente ya que ya no es necesaria durante la adquisición de lapso de tiempo. Cubra la platina con la caja de seguridad láser (Figura 1I). Cuando se utiliza el sistema de detección interno, la caja de seguridad láser es adecuada para la protección contra la luz de fondo. Presione "start".
NOTA: Sin embargo, con sistemas de detección externos más sensibles, la caja de seguridad láser no bloquea suficiente luz de fondo y se requieren cubiertas adicionales para evitar la interrupción de la adquisición de imágenes.
2. Durante la adquisición de lapso de tiempo
1. Rellene la cámara de baño abierta con medios embrionarios de lapso de tiempo cada 8-12 h (al menos 2 veces al día) durante la adquisición de lapso de tiempo a través de las puertas correderas de la caja de seguridad láser (Figura 1I).
2. Antes de abrir las puertas de la caja de seguridad láser, asegúrese de que el microscopio no esté adquiriendo activamente una imagen.
NOTA: El uso de calentadores y sistemas de medios circulantes no es necesario para experimentos de imágenes de lapso de tiempo que duran de 24 a 48 h. De hecho, las temperaturas de los calentadores de etapa y en línea son difíciles de controlar, y durante la adquisición de imágenes el embrión exhibe una tasa de desarrollo adecuada en un rango de temperatura de 25-28 °C. Además, los sistemas de medios circulantes tienden a desbordarse y dañar potencialmente el equipo. Por lo tanto, todos los embriones se estadifican de forma rutinaria después de la adquisición.
3. Procesamiento posterior a la adquisición
1. En el software, haga clic en el menú "archivo" y elija "guardar".
2. Abra el archivo en el software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de Materiales). Resalte la serie de imágenes correcta. En el software, elija el menú "Proceso". Haga clic en Deconvolución 3D y "Aplicar" para desconvolucionar cada pila z.
NOTA: El archivo es grande; Por lo tanto, este paso puede tardar muchas horas.
3. En el software, en el menú "Proceso", haga clic en "proyección máxima". Haga clic en "Aplicar" para iniciar la proyección máxima y generar 1 imagen por pila z. Exporte cada archivo proyectado máximo (1 imagen por pila z) como un tiff.
4. Importa archivos tiff individuales en software de procesamiento de video. Selecciona todos los archivos tiff y arrástralos al editor de vídeo. Ajusta la duración de cada imagen dentro del video a 0.1s. Exporta video como archivo mov o mp4.
