Visualización de los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila

Abstract

Fuente: Jeong, S. Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra la visualización de proyecciones axonales en embriones de Drosophila. El inmunomarcaje de las neuronas motoras, la disección precisa para exponer las estructuras neuronales y la microscopía de contraste de interferencia diferencial revelan colectivamente una arquitectura neuronal detallada, enfatizando los patrones de proyección axonal.

Protocol

1. Preparación

1. Prepare 500 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con solución de t-Octilfenoxipolietoxietanol (PBT) añadiendo 0,5 g de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,5 mL de t-Octilfenoxipolietoxietanol (ver la Tabla de Materiales) a 500 mL de PBS 1X y agitando durante al menos 30 min. Almacene a 4 °C. Úselo cuando esté relativamente fresco y almacene la solución en una botella limpia.
2. Prepare 10 mL de paraformaldehído al 4% agregando 2,5 mL de solución de paraformaldehído al 16% y 1 mL de PBS 10x a 6,5 mL de agua desionizada. Almacenar a 4 °C y utilizar en el plazo de una semana.
   PRECAUCIÓN: Evite el contacto de la piel con la solución de paraformaldehído porque es altamente tóxico.
3. Elabore un sustrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal) (10% p/v de X-Gal en dimetilsulfóxido (DMSO)) disolviendo 0,1 g de sustrato X-Gal por 1 mL de DMSO. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 100 μL.
4. Prepare la solución de tinción X-Gal con tampón de fosfato de 10 mM (pH 7,2), cloruro de sodio de 150 mM, NaCl, cloruro de magnesio de 1 mM, MgCl₂, ferrocianuro de potasio de 3 mM, K₄ [FeII(CN)₆], 3 mM de ferricianuro de potasio, K₃ [FeIII(CN)₆] y t-otilfenoxipolietetanol al 0,3%. Conservar a 4 °C en la oscuridad.
5. Haga una solución de peróxido de hidrógeno al 3% diluyendo peróxido de hidrógeno al 30% 1:10 con agua desionizada.
6. Prepare la solución de 3,3′-diaminobenzidina (DAB) disolviendo completamente 1 tableta (10 mg) de DAB en 35 mL de solución fresca de PBT. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenar a -20 °C en alícuotas de 910 μL.
   PRECAUCIÓN: Deseche todos los residuos de DAB en lejía para destruir el DAB.
7. Prepara platos de huevo con jugo de manzana. Añadir 35 g de agar y 1 L de agua desionizada a un matraz de 2 L. Añadir 33 g de sacarosa, 2 g de tegosept y 375 mL de zumo de manzana a un matraz de 1 litro. Derrítelos en autoclave durante 30 min. Deje que ambas soluciones se enfríen a unos 60 °C. Combine y mezcle bien estas soluciones agitando. Vierta ~11 mL de la solución combinada por placa de cultivo de 60 mm.
8. Prepare la pasta de levadura mezclando levadura de panadería con agua desionizada (proporción 1:0,8) y almacene a 4 °C.

2. Recolección de embriones (día 1)

1. Recoja moscas hembra y macho jóvenes (menos de 5 días) y durante 1-2 días, manténgalas en una jaula de plástico con una placa de huevos (60 mm x 15 mm) que contenga una pequeña cantidad de pasta de levadura en el centro.
2. Para una recolección óptima de embriones de 16 años tardíos, instale una jaula de biberón con moscas (> 50) alrededor de las 5 p.m. y déjelas poner huevos a 25 °C durante 3 h.
3. Transfiera las moscas a una botella de comida fresca.
4. Cierre la placa de huevos con la tapa e incube boca abajo a 25 °C en una incubadora humidificada (~70% de humedad) durante la noche.

3. Preparación de embriones para inmunotinción (Día 2)

1. Agregue 1.8 mL de solución de PBT a la placa de huevos alrededor de las 10:20 a.m. y use un hisopo de algodón para aflojar los embriones de la placa mientras la inclina.
   NOTA: Al triturar suavemente la pasta de levadura con un hisopo de algodón, disuélvala en caso de que se encuentre una gran cantidad de embriones en ella. Comience a recolectar los embriones ~ 40 minutos antes de la fijación (alrededor de las 11:00 a.m.).
2. Transfiera los embriones de la placa de óvulos a un microtubo de 1,5 ml con una punta de pipeta de 1 ml.
3. Permita que los embriones se asienten y aspiren la solución de PBT tanto como sea posible. Enjuague los embriones dos veces con 1 ml de solución de PBT. Aspire la solución PBT tanto como sea posible.
4. Llene el tubo con 1 mL de lejía al 50% (es decir, diluida en agua desionizada) y descorione los embriones incubándolos en un nutator durante 3 min a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Este paso no mata los embriones descorionados.
5. Deje que los embriones decorionados se asienten, aspire la lejía al 50% tanto como sea posible y enjuague los embriones 3 veces con 1 ml de solución de PBT.
6. Agregue 0,5 mL de heptano y posteriormente agregue 0,5 mL de solución de paraformaldehído al 4% al tubo en RT alrededor de las 11:00 AM.
7. Incubar los embriones en un nutator durante 15 min a RT.
8. Retire la solución de paraformaldehído al 4% (la capa inferior).
9. Añadir 0,5 mL de metanol al 100% y devitellinizar los embriones agitando el tubo vigorosamente durante 30 s.
10. Retire el heptano (es decir, la capa superior).
11. Añadir 0,5 mL de metanol al 100% y agitar el tubo enérgicamente durante 10 s.
12. Permita que los embriones se asienten golpeando el tubo y aspire el metanol tanto como sea posible. Enjuague los embriones con 1 mL de metanol al 100%, agitando durante menos de 10 s.
    NOTA: La exposición prolongada al metanol destruye la actividad de β-Gal.
13. Retire el metanol y enjuague los embriones devitellinizados 3 veces con 1 mL de solución de PBT.

4. Genotipado de los embriones mediante tinción LacZ (día 2)

1. Añada 1 ml de solución de PBT al tubo e incube el tubo en un bloque de calor a 37 °C o en un baño de agua durante 15 min.
2. Durante la incubación, coloque la solución de tinción X-Gal (1 ml por tubo) a 65 °C en un baño de agua hasta que se turbie. Incubar en un baño de agua a 37 °C.
3. Aspire la solución de PBT y agregue 1 ml de solución de tinción X-Gal y 20 μl de sustrato X-Gal al tubo.
4. Incubar el tubo a 37 °C con nutación hasta que se note un precipitado azul.
   NOTA: El tiempo de incubación para el 2º y 3º balanceadores azules en general oscila entre 2 y 4 h.
5. Retire la solución de tinción X-Gal y enjuague los embriones 3 veces con 1 ml de solución RT PBT.
6. Con una sonda de aguja o pinzas, clasifique a mano los embriones del genotipo deseado (es decir, embriones blancos no teñidos) con un microscopio de disección óptica (objetivos de 1,6X-2,5X)
   NOTA: Dado que algunos equilibradores azules, como CyO, actina-LacZ y TM3, actina-LacZ, llevan una construcción transgénica que expresa β-Gal bacteriana (LacZ) bajo el control de la actina promotor, los embriones teñidos de azul de manera ubicua contienen una o dos copias de cromosomas balanceadores azules. Por lo tanto, los embriones blancos no teñidos son homocigotos para el alelo letal deseado.

5. Inmunotinción de embriones con anticuerpos antifasciclina II (día 2-3)

1. Recoja y transfiera los embriones del genotipo deseado (es decir, embriones blancos no teñidos) a un microtubo de 0,5 mL utilizando una punta de pipeta de 1 mL.
   NOTA: En este paso, los embriones se pueden clasificar aproximadamente de acuerdo con criterios morfológicos, incluidos los patrones de segmentación de la cutícula y las estructuras de la cabeza y la cola. Durante la involución de la cabeza, entre 10 y 16 h después de la puesta de los huevos, el embrión experimenta una reducción pronunciada del segmento anterior.
2. Lavar los embriones una vez con 0,4 mL de solución de PBT y añadir 0,3 mL de solución bloqueante (5% de suero normal de cabra y 5% de DMSO en solución de PBT).
3. Bloquear los embriones con nutación a RT durante 15 min.
4. Añadir 75 μL de anticuerpo anti-fasciclina II e incubar el tubo con nutación en RT durante la noche.
5. Lavar los embriones 4 veces con 0,4 mL de solución de PBT durante al menos 20 min por lavado.
6. Añadir 0,3 mL de solución bloqueante (suero de cabra normal al 5% en solución de PBT) que contenga anticuerpo peroxidasa anti-ratón-rábano picante de cabra (anti-ratón-HRP) (2 μg/mL) e incubar el tubo con nutación a RT durante la noche.
7. Lavar los embriones 6 veces con 0,4 mL de solución de PBT durante al menos 20 min por lavado.
8. Agregue 0.3 mL de solución de DAB al tubo.
   PRECAUCIÓN: Use guantes y coloque todos los desechos/tubos/puntas de DAB en lejía.
9. Añadir 2 μL de peróxido de hidrógeno al 3% e incubar el tubo en la oscuridad con nutación a RT hasta que se produzca la cantidad deseada de precipitado.
   NOTA: El tiempo de incubación de la inmunohistoquímica 1D4 en general oscila entre 0,5 y 1 h.
10. Lavar los embriones 4 veces con 0,4 mL de solución de PBT.
    PRECAUCIÓN: Retirar la solución de DAB y los dos primeros lavados con pipeta y desecharlos con lejía.
11. Añada 0,2 mL de solución de glicerol/PBS al 70% de montaje al tubo y guárdelo a RT o 4 °C.
    NOTA: Mantenga el tubo alejado de la luz. Se pueden obtener preparaciones más claras colocando los embriones en una solución de glicerol/PBS al 90%. Sin embargo, es más difícil diseccionar los embriones aclarados en una solución de glicerol/PBS al 90% que los aclarados en una solución de glicerol/PBS al 70%.

6. Estadificación, disección, montaje y obtención de imágenes de los embriones (día 4)

1. Para la estadificación, transfiera los embriones equilibrados con 70% de glicerol/PBS a un portaobjetos de vidrio.
2. Recoja embriones de etapa tardía 16 que tengan nervios intersegmentales (ISN) del segmento abdominal 7 (A7), A8 y A9 que converjan entre sí y/y tengan un intestino medio subdividido en tres bandas.
   NOTA: Los embriones teñidos con el anticuerpo 1D4 se pueden clasificar en función de los patrones de proyección de los axones motores ISN e ISNb. Después de salir del sistema nervioso central (SNC), los nervios ISN A7, A8 y A9 de los embriones en etapa tardía 16 convergen para tocarse entre sí y posteriormente divergen para extenderse hasta los músculos dorsales (punta de flecha en la Figura 1A). Sin embargo, en los embriones de la etapa 16 media, los nervios A7 ISN se extienden en paralelo con los nervios A8/A9 (corchetes en la Figura 1B). Además, los ejes de proyección de los nervios A6 ISNb (perpendiculares a los músculos ventrolaterales) en ambos hemisegmentos están aproximadamente alineados con el extremo posterior de los fascículos axónicos longitudinales del SNC (flechas y una línea en la Figura 1C). Estos criterios morfológicos varían entre los diferentes genotipos. Alternativamente, los embriones se pueden clasificar en etapas según la morfología intestinal. Antes de la etapa 17, el intestino medio tiene una forma de corazón, mientras que el intestino medio se subdivide en tres bandas en la etapa 17.
3. Disecciona los embriones.
   1. Usando una jeringa de 1 mL, saque cada embrión de la gota de glicerol y coloque el embrión boca arriba ventralmente. Cortar la parte anterior a 1/4 de la longitud del cuerpo y la región más posterior que está libre de axones motores.
   2. Con una sonda de aguja, saque el embrión cortado en el extremo de la gota de glicerol, gírelo para orientarlo con el lado dorsal hacia arriba y colóquelo horizontalmente en el campo.
      NOTA: Cuando el embrión se mueve fuera de la gota de glicerol, un poco de glicerol asociado con el embrión lo hace pegajoso.
   3. Corta el embrión a lo largo de la línea media dorsal con una sola aguja de tungsteno muy fina. Haga un pequeño corte en el extremo posterior del embrión y luego continúe cortando la línea media dorsal hacia la anterior; Cortar en la dirección opuesta también está bien.
   4. Con una sonda de aguja, mueva el embrión cortado en la línea media dentro de la gota de glicerol, colóquelo con el lado dorsal hacia arriba y separe el intestino de la pared corporal desplegando cada pared corporal en dirección ventrolateral (diagonal) (objetivo 2.5X).
      NOTA: Asegúrese de que la línea media dorsal esté completamente cortada, lo que resulta en la separación completa entre las paredes del cuerpo izquierda y derecha.
   5. Retire con cuidado el embrión cortado en la línea media de la gota de glicerol y luego coloque dos solapas de la pared del cuerpo sobre el portaobjetos de vidrio con una sonda de aguja fina (objetivo 2,5X).
   6. Usando una aguja de tungsteno muy fina, extraiga los órganos internos del embrión diseccionado empujándolos lateralmente (objetivo 5X).
      NOTA: Una descripción más detallada de otro procedimiento de disección similar se puede encontrar en el sitio web.
4. Para el montaje, agregue 2-3 μL de solución de glicerol/PBS al 70% en los embriones limpios y disecados y, con una sonda de aguja fina, transfiéralos a un nuevo portaobjetos de vidrio en el que se hayan extendido 8 μL de solución de glicerol/PBS al 70% en el centro (objetivo 2,5X).
5. Colóquelo en un cubreobjetos (18 mm x 18 mm). Sella los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas regular (ya sea transparente o de color está bien).
6. Capture imágenes a alta resolución (objetivos de inmersión en aceite de 20X, 40X y 63X) bajo un microscopio óptico de contraste de interferencia diferencial (DIC), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Se puede producir una mejor visualización y caracterización fenotípica, especialmente para los axones del motor ISNb, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63X.

Results

Figura 1: Estadificación de los embriones basada en los patrones de proyección de los axones motores ISN e ISNb. (A) En los embriones de tipo salvaje en la etapa tardía de 16, los nervios A7, A8 y A9 ISN (flechas) convergen para tocarse e...

Materials