Imágenes in vivo del cerebro de larvas de pez cebra para visualizar neuronas cerebelosas

Resumen

Fuente: Schramm, P. et al. Obtención de imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extracción de cráneo y piel. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra la imagen in vivo de neuronas cerebelosas en larvas de pez cebra transgénicas, que expresan proteínas fluorescentes en neuronas de Purkinje. El proceso consiste en anestesiar las larvas, inmovilizarlas en agarosa y eliminar cuidadosamente la piel pigmentada para mejorar la penetración de la luz y la intensidad de la fluorescencia. Finalmente, las muestras preparadas se visualizan bajo un microscopio confocal para visualizar claramente las neuronas marcadas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Anestesia de larvas y preparaciones para la incrustación
   1. Al comenzar el experimento del día, transfiera los animales que se necesitan con una pipeta Pasteur de plástico a una placa de Petri de 90 mm de diámetro, que está llena de Danieau (para las larvas que aún se mantienen en una placa de Petri con Danieau) o agua de la instalación de peces (para las larvas que tienen más de 7 días después de la fertilización [dpf] y se mantienen en la instalación de pescado).
      1. Al pipetear peces de más de 2 semanas, asegúrese de que la abertura de la pipeta sea lo suficientemente grande para evitar lesionar a los peces al transferirlos. No use una red porque dañará físicamente a los peces, especialmente a las larvas más jóvenes.
   2. Añadir nauplios rotifera o artemia adecuados al tamaño de las larvas mantenidas en la placa de Petri para garantizar el libre acceso a los alimentos y el máximo estado de salud de las larvas y reducir el estrés.
   3. Para su inclusión, transfiera las larvas seleccionadas a una placa de Petri de 35 mm de diámetro llena de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF). Añadir el volumen necesario de d-Tubocurarina para alcanzar una concentración de trabajo/dosis efectiva de 10 μM y esperar unos minutos hasta que las larvas estén completamente inmovilizadas.
      NOTA: Cuando los peces envejecen o si se necesita una anestesia completa más rápida (menos de 5 min), es posible aumentar la concentración de d-Tubocurarina (la DL50 para ratones es de 0,13 mg/kg por vía intravenosa). También es posible utilizar un anestésico diferente, como la α-bungarotoxina (concentración de trabajo: 1 mg/mL), que tiene el mismo efecto que el curare y también mantiene el cerebro completamente activo. Si no es necesario un cerebro completamente activo para el tema de interés, la tricaína en una dosis no letal (0,02%) también es una opción para anestesiar completamente las larvas. Sin embargo, la tricaína bloquea los canales de sodio, lo que perjudica la actividad cerebral.
   4. Prepare la cámara de montaje tomando la tapa de la placa de Petri de 35 mm de diámetro, voltee la tapa boca abajo y coloque un cubreobjetos de vidrio cuadrado (24 x 24 mm) en la parte inferior de la tapa. Consulte la Figura 1 (parte superior) para obtener una descripción esquemática de estos pasos. La superficie más lisa del vidrio evita que el bloque de agarosa, que contiene las larvas, durante el procedimiento de apertura del cráneo.
   5. Alícuota la cantidad de ACSF necesaria para el día en un vial adecuado (por ejemplo, tubo de 50 mL, vaso de precipitados, frasco Schott, etc.) y oxigenarlo con carbógeno (5% CO₂, 95% O₂). Si solo se obtienen imágenes de la morfología (por ejemplo, patrones de fluorescencia), la ACSF sigue siendo necesaria para garantizar la integridad del cerebro y que las células no se vean afectadas negativamente por los efectos de la osmolaridad, pero no es necesaria la oxigenación de la ACSF. Este paso solo debe realizarse cuando se necesita una actividad cerebral completa para la obtención de imágenes.
      NOTA: Para una saturación óptima de oxígeno del medio, agregue una piedra difusora al extremo del tubo de carbógeno. Para garantizar un nivel de oxígeno suficientemente alto, es necesario cambiar el ACSF en las cámaras de imagen por ACSF recién oxigenado cada 20-60 min, dependiendo del número y la edad de las larvas incrustadas en la misma cámara de imagen (por ejemplo, para una sola larva incrustada, el intercambio cada hora es suficiente. Para seis larvas de más de 14 dpf incrustadas en paralelo, es necesario intercambiar ACSF cada 20 min), por lo que planifique la cantidad necesaria de ACSF saturado de oxígeno de acuerdo con el experimento planificado.
2. Incrustación de las larvas
   1. Transfiera las larvas completamente anestesiadas con una pipeta Pasteur de plástico a la cámara de montaje preparada (en el paso 1.4). Luego, retire con cuidado el exceso de medio para evitar la dilución de la agarosa de bajo punto de fusión (LM). Todos los pasos siguientes deben realizarse bajo un microscopio estereoscópico con suficiente aumento.
      NOTA: Inclinar la cámara de montaje puede ayudar a eliminar completamente el medio.
   2. Proceda inmediatamente al siguiente paso, añadiendo una gota de LM-agarosa suficientemente grande sobre las larvas (alrededor de 1 mL, dependiendo del tamaño de las larvas) para proteger a los animales de la desecación y reducir el estrés innecesario.
   3. Oriente las larvas en su posición antes de que la agarosa se solidifique. Asegúrese de que la parte dorsal de las larvas se dirija hacia arriba. Además, asegúrese de incrustar las larvas lo más cerca posible de la superficie de la agarosa.
      NOTA: Dependiendo del tamaño y la cantidad de larvas que se planea incrustar al mismo tiempo, es posible ajustar la concentración de agarosa. Por ejemplo, para 1-3 larvas de 30 dpf de edad, se recomienda una concentración de 1,8%-2% de LM-agarosa. Para 1-4 larvas que tienen 7 dpf de edad, es más factible usar 2.5% de LM-agarosa, mientras que para 5-8 larvas, 2% es más adecuado. Si se requiere un cerebro completamente activo, se recomienda incorporar solo tres peces al mismo tiempo para reducir el tiempo necesario para operar las larvas. En general, se recomienda utilizar concentraciones más bajas (1,8%-2%) cuanto más viejas se vuelven las larvas, o cuanto más larvas se planea incrustar al mismo tiempo.
   4. Si las imágenes se registran con un microscopio invertido, recorte el bloque de agarosa que contiene las larvas en una pequeña forma de cuboide. Esto es importante para transferir las larvas a la cámara de imágenes más adelante. Si se utiliza un microscopio vertical, no es necesario dicho recorte, ya que la cámara de montaje también se puede utilizar como cámara de imágenes. En la Figura 1 (parte superior), se puede encontrar una descripción esquemática de estos pasos.
3. Exposición del cerebro
   NOTA: Todos los siguientes pasos deben realizarse con el mayor cuidado para no dañar innecesariamente a las larvas. Si se requiere un cerebro completamente activo para el experimento, tenga en cuenta que con cada segundo que pasa, mientras el pez todavía está completamente montado en agarosa y tiene un cráneo abierto sin ACSF oxigenado, el cerebro sufrirá una falta de oxígeno y se secará. Los efectos de la deficiencia de oxígeno se volverán aún más dramáticos cuanto más viejas sean las larvas incrustadas. Por lo tanto, es importante realizar la cirugía no solo en el menor tiempo posible, sino también con la máxima precisión para evitar daños mecánicos cerebrales con la aguja. Los pasos 3.2-3.4 no deben tomar más de 30 s por pez cuando están entrenados.
4. Comience la cirugía tan pronto como la agarosa se haya solidificado. Primero, recorte todo el exceso de agarosa por encima de la región del cerebro de interés para obtener acceso libre a la cabeza y un espacio de trabajo despejado. Si la parte dorsal de la cabeza ya sobresale de la agarosa, omite este paso.
5. Dependiendo de la región de interés, elija un lugar para comenzar con la cirugía. Tome la aguja de vidrio y haga una pequeña incisión a través de la piel sin penetrar demasiado profundamente en el tejido. Este será el punto de partida para pelar la piel superpuesta.
   NOTA: Para obtener resultados óptimos, nunca comience directamente sobre la región de interés para reducir el riesgo de dañar estructuras importantes. Si es necesario, es posible comenzar por detrás del cerebro posterior y avanzar hasta que se retire el área no deseada de la piel.
6. Continúe con cortes muy pequeños a lo largo de la parte de la piel, con el objetivo de eliminar apenas moviendo la aguja justo debajo de la superficie. La mayoría de las veces no es necesario moverse completamente alrededor del cerebro y cortar un trozo de piel y cráneo en forma de círculo, sino que simplemente se hacen dos incisiones a lo largo de la cabeza y luego empujan la piel hacia un lado u otro. La Figura 2 muestra una representación esquemática de la estrategia de corte óptima para obtener acceso libre al cerebelo.
   NOTA: Esta microcirugía es un procedimiento delicado y lo más probable es que necesite algo de entrenamiento para extirpar la piel perfectamente sin dañar el cerebro subyacente. También se recomienda encontrar la estrategia de corte óptima para la región del cerebro de interés y mantenerla durante todo el experimento.
7. Inmediatamente después de quitar la piel de todas las larvas incrustadas, vierta ACSF (oxigenado) sobre la agarosa para inundar las partículas de piel y sangre no deseadas, mantener el cerebro completamente activo y protegerlo de la desecación.
   NOTA: Si se necesita un cerebro sano para el experimento, se recomienda optar por un máximo de tres peces a la vez.
8. Si usa un microscopio vertical, comience directamente con las imágenes.
   1. Cuando utilice un microscopio invertido, deslice una pequeña espátula por debajo del bloque de agarosa cuboide (paso 2.4).
   2. Agregue una pequeña gota de LM-agarosa al fondo de la cámara de imagen (por ejemplo, un plato con fondo de vidrio) e inmediatamente voltee el bloque de agarosa que contiene las larvas con la espátula 180° y empújelo suavemente hacia el fondo de la cámara de imagen, mientras la gota de agarosa líquida actúa como pegamento.
   3. Cuando la agarosa se haya solidificado, llene la cámara de imágenes con ACSF (oxigenada) y luego comience la toma de imágenes. Véase la Figura 1 (parte inferior) para una descripción esquemática.
9. Cuando se requiera una actividad cerebral completa para el experimento, asegúrese siempre de que el ACSF en la cámara de imágenes tenga un nivel de oxígeno suficientemente alto. Para garantizar esto, el medio debe cambiarse cuidadosamente con ACSF recién oxigenado cada 20-60 min (dependiendo del número y tamaño de los peces, el tamaño y la superficie de la cámara de imagen y la duración de la imagen).

Resultados

Figura 1: Procedimiento esquemático para la preparación de peces cebra de cráneo abierto para imágenes in vivo de manera escalonada. Las instrucciones de trabajo para los diferentes pasos se pueden e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Confocal Microscopio de barrido láser	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Capilar de vidrio tipo 1	WPI	1B150F-4
Vidrio Capilar tipo 2	Harvard Apparatus	GC100F-10
Cubreobjetos de vidrio	deltalab	D102424
Cámara de imagen	Ibidi	81156
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Cámara microscópica	Leica	DFC9000 GTC
Needle-Puller tipo 1	NARISHIGE	Modelo PC-10
Tirador de agujas tipo 2	Sutter Instruments Modelo	P-2000
Pasteur-Pipetas 3ml	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Placa de Petri de 35 mm	Sarstedt	833900
Placa de Petri de 90 mm	Sarstedt	821473001