Caracterización de las propiedades mecánicas del tejido cerebral de ratón mediante microscopía de fuerza atómica

Resumen

Fuente: Canovic, E. P., et al. Caracterización de las propiedades mecánicas multiescala del tejido encefálico mediante microscopía de fuerza atómica, indentación por impacto y reometría. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra el uso de la microscopía de fuerza atómica (AFM) para medir las propiedades viscoelásticas del tejido cerebral, donde un voladizo con una sonda esférica interactúa con el tejido y se dobla bajo las fuerzas aplicadas. Un rayo láser desviado hacia un detector rastrea el voladizo para medir la profundidad de la hendidura y la relajación de la fuerza, lo que permite la caracterización de las propiedades mecánicas del tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Clavija habilitada para microscopio de fuerza atómica (AFM)

1. Prepare placas de Petri (P60) de 60 mm de diámetro con un bioadhesivo derivado del mejillón de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Prepare un stock de solución tampón neutra compuesta por bicarbonato sódico 0,1 M en agua estéril con un pH óptimo de 8,0. Filtrar-esterilizar (0,2 micras) el tampón de bicarbonato de sodio y almacenarlo a 4 °C.
   2. En una campana de flujo laminar, mezcle una solución de bioadhesivo derivado del mejillón al 6,25 % y hidróxido de sodio (NaOH) al 3,125 % en el tampón de bicarbonato de sodio.
   3. Pipetear 100 μl de la solución bioadhesiva en una placa de Petri (P60) de 60 mm de diámetro y utilizar una punta de pipeta para extender la solución en un círculo de 3-5 cm de diámetro.
   4. Deje los platos P60 descubiertos en una campana de flujo laminar y deje que la solución se seque (~30 min). Lave los platos 1 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 2 veces con agua estéril. Deje que los platos se sequen al aire en una campana de flujo laminar y guárdelos en una bolsa de plástico sellada a 4 °C hasta por 1 mes.
2. Calibra el AFM y configura una muestra de cerebro en el AFM. nota: Siga las instrucciones de calibración de AFM según el fabricante.
   1. Cargue cuidadosamente una sonda AFM con una constante de resorte nominal de 0.03 N/m y un cordón de borosilicato de 20 μm de diámetro en el soporte de la sonda.
   2. Calibrar la constante de resorte y la sensibilidad inversa de la palanca óptica (InvOLS) del voladizo AFM utilizando el método de ajuste térmico.
      NOTA: Una vez que se calcula la constante de resorte para una sonda AFM, debe permanecer constante con el uso repetido. Sin embargo, el InvOLS en voladizo deberá recalibrarse cada vez que el láser se realinee con el voladizo. Además, la calibración debe realizarse contra un sustrato varios órdenes de magnitud más rígido que el voladizo, como el poliestireno.
   3. Encienda el calefactor montado en la etapa y ajuste la temperatura a 37 °C.
   4. Monta la rebanada de cerebro en los platos P60.
      1. Vierta suavemente una rebanada de cerebro de 350 μm de grosor y el medio independiente del dióxido de carbono (CO₂) del matraz de fondo redondo en un plato P60 recubierto con el bioadhesivo derivado del mejillón.
      2. Coloque la rebanada de cerebro en el centro del plato P60 inclinándola suavemente. Si es necesario, pipetee lentamente el medio con una pipeta manual para desplegar una rebanada de cerebro que se haya doblado sobre sí misma, o mejor aún, coloque la rebanada de sepia en el centro del plato.
      3. Retire con cuidado el exceso de medio con una pipeta P1000 (no utilice la aspiradora).
      4. Coloque una tapa en el plato P60 y deje que la rodaja de cerebro se adhiera durante 20 minutos.
   5. Retire el cabezal AFM, coloque la rebanada de cerebro montada en el plato P60 en la etapa AFM y agregue ~ 2 ml de medio independiente de CO₂ precalentado.
   6. Agregue con cuidado una gota de medio a la sonda AFM para protegerla de la rotura debido a la tensión superficial cuando se baje en el medio que rodea el corte de cerebro.
   7. Vuelva a colocar el cabezal AFM en el escenario y comience a bajarlo hasta que se sumerja en el medio.
   8. Con la cámara del dispositivo de carga acoplada (CCD) de vista superior, vuelva a colocar el láser en el voladizo.
      NOTA: La alineación del láser en el voladizo habrá cambiado ligeramente debido a la diferencia en el índice de refracción del aire y el medio.
   9. Espere 5 minutos para que el voladizo se adapte a sumergirse en un líquido caliente, luego restablezca la alineación del espejo a una deflexión libre de 0 V.
   10. Ejecute un espectro térmico en la sonda AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice el ajuste del primer pico térmico para recalcular el InvOLS de la sonda AFM en los medios.
   11. Usando el microscopio óptico, mueva la etapa de la muestra de modo que la región del cerebro de interés esté debajo de la sonda AFM. nota: El cuerpo calloso aparecerá oscuro ya que es más opaco que la materia gris circundante. La corteza es superior al cuerpo calloso.
   12. Restablezca la alineación del espejo a una deflexión libre de 0 V.
   13. En el medidor de suma y deflexión en el software AFM, haga clic en "Activar" para activar el cabezal AFM.
   14. Usando el dial de posición en el cabezal AFM, baje el cabezal hasta que se haga contacto entre el voladizo y la muestra.
3. Llevar a cabo experimentos de cumplimiento de fluencia.
   1. Construye una función de fuerza aplicada en el editor de funciones del software. La función de fuerza consiste en una rampa de 0,1 segundos hasta un punto de ajuste de 5 nN y mantenerlo durante 20 segundos, seguido de una rampa de 1 segundo hasta una fuerza aplicada de 0 nN.
      1. En el Panel Maestro de Sangría, bajo el método de sangría, seleccione "Cargar" para el Modo de Indentero, "N" para las unidades y "Editor de funciones" para la Función de Indenter
      .
      2. En el editor de funciones, en el Panel de Parms de segmento, cree un segmento de función de fuerza aplicada que comience en 0 nN y termine en 5 nN, con un tiempo de 0,1 seg. Haga clic en "Insertar -->".
      3. Para el siguiente segmento, establezca el inicio en 5 nN, el final en 5 nN y el tiempo en 20 segundos. Haga clic en "Insertar -->".
      4. Para el segmento final, establezca el inicio en 5 nN, el final en 0 nN y el tiempo en 1 seg. A continuación, haz clic en "Dibujar" y cierra la ventana del Editor de funciones.
   2. En la pestaña Fuerza del panel principal, marque "rampa de indentación después del disparo" y configure la función de fuerza aplicada para que se dispare después de alcanzar un punto de disparo de 0,1 V.
   3. Haga clic en "Fuerza única" en la parte inferior de la pestaña Fuerza del Panel Maestro, lo que activará la función de fuerza construida y aplicada para el cumplimiento de la fluencia.
   4. Una vez finalizada la indentación de fuerza única, levante la cabeza del AFM para que quede fuera de contacto con la muestra. A continuación, vuelva a enganchar la cabeza y vuelva a poner a cero la deflexión libre.
   5. Vuelva a colocar la platina de muestra para localizar una nueva área de interés y baje el cabezal del AFM para hacer contacto. nota: El cabezal AFM debe retraerse de la superficie de la muestra cuando se mueve la etapa de muestra. De lo contrario, se puede dañar el delicado voladizo AFM.
   6. Repita los pasos hasta que se haya recopilado la cantidad deseada de datos.
4. Realiza experimentos de relajación de la fuerza.
   1. Construye una función de sangría aplicada en el editor de funciones del software. La función de sangría consiste en una rampa de 0,1 segundos hasta un punto de ajuste de 3 μm y mantenerlo durante 20 segundos, seguido de una rampa de 1 segundo hasta una profundidad de sangría de 0 μm.
      1. En el Panel Maestro de Sangría, bajo el método de sangría, seleccione "Sangría" para el Modo de Indentero, "m" para las unidades y "Editor de funciones" para la Función de Indenter
      .
      2. En el editor de funciones, en el Panel de Parms de segmento, cree un segmento de función de fuerza aplicada que comience en 0 μm y termine en 3 μm, con un tiempo de 0,1 seg. Haga clic en "Insertar -->".
      3. Para el siguiente segmento, establezca el inicio en 3 μm, el final en 3 μm y el tiempo en 20 segundos. Haga clic en "Insertar -->".
      4. Para el segmento final, establezca el inicio en 3 μm, el final en 0 μm y el tiempo en 1 seg. A continuación, haga clic en "Dibujar" y cierre la ventana del Editor de funciones.
   2. En la pestaña Fuerza del panel principal, marque "rampa de indentación después del disparo" y configure la función de fuerza aplicada para que se dispare después de alcanzar un punto de disparo de 0,1 V.
   3. Haga clic en "Fuerza única" en la parte inferior de la pestaña Fuerza del Panel Maestro para activar la función de sangría construida-aplicada para la relajación de la fuerza.
   4. Una vez finalizada la indentación de una sola fuerza, levante la cabeza AFM para que quede fuera de contacto con la muestra, luego vuelva a acoplar la cabeza y vuelva a poner a cero la deflexión.
   5. Reposicione la platina para ubicar una nueva área de interés y baje la cabeza para hacer contacto.
   6. Repita ambas mediciones hasta que se haya recopilado la cantidad deseada de datos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hibernate-A medium	Gibco	A1247501	medio neural independiente de CO2 para tejido adulto
Microscopio de fuerza atómica, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Calentador de placa de Petri	Asylum Research	-
Sonda AFM, 0,03 N/m, esfera de borosilicato de 10 mmm de radio	Novascan	PT. GS
Cell-Tak	Corning	354240	Bioadhesivo derivado del mejillón
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761	pueden utilizar proveedores alternativos
Hidróxido de sodio, 1N	Sigma-Aldrich	59223C	Se pueden utilizar proveedores alternativos

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