Título encapsulación celular a través de gotitas

Protocolo

NIH3T3 células de preparación:

A. Las células de eyección

1. Trypsinize las células, y luego se diluye 1:1 con los medios de comunicación celular, y la transferencia de un frasco T75 a un tubo de 15 ml Falcon
2. Centrifugar las células en un pellet por centrifugación, se aspira el sobrenadante y lavar las células con DPBS
3. Centrifugar las células en una bolita de nuevo, y aspirar el sobrenadante
4. Resuspender las células en los medios de comunicación
5. Determinar la densidad celular con hemocitómetro (~ 200 X 10 ⁴ células / ml por frasco T75)
6. Solución de centrífuga de células, se aspira el sobrenadante y resuspender en cantidad adecuada de los medios de comunicación para diferentes concentraciones de células

B. expulsión de la célula

1. Vortex antes de usar las células para la eyección
2. Transferencia de 200 l de solución de células en la jeringa
3. Establecer el modo apropiado en el generador de impulsos
   1. Para la expulsión de gotas individuales y múltiples gotas (ráfagas), generador de pulso para "E. Bur" modo de
   2. Para la eyección de gota continua, generador de pulso en "NORM" modo de
4. Cambiar la configuración de la señal
   1. Establecer el nivel de alta y baja tensión Nivel de salida: LIS a 5 V y LOL a 0 V y asegúrese de que el "LIM" está encendido
   2. Establecer como una señal de pulso cuadrado
   3. Cambiar la cantidad de tiempo que la válvula solenoide se abre para la eyección de gotas, cambiando el valor de "MED" o cambio de ciclo de trabajo ("derecho")
   4. Cambiar la frecuencia de la expulsión, cambiando el valor de "PER"
   5. Cambiar el número de gotas expulsadas en una explosión al cambiar el valor de "Bur"
5. Solución de células de expulsión sobre el sustrato preparado para imágenes con microscopio

C. La tinción

1. Conforman solución colorante con 0,5 l calceína-AM y 2 l homodímero de etidio por ml de DPBS
2. Sumergir sustrato preparado en la solución colorante
3. Que la muestra de incubar durante 10 minutos a 37 ° C antes de exponer

Experimento de Validación

1. En una Nikon Eclipse TE-2000 microscopio fluorescente U
   1. Punto avanzado de software (Diagnostics, Inc.)
   2. Live / Dead ensayo

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio fluorescente		Nikon Instruments	Eclipse TE-2000 U
Eyector de células con válvula solenoide				Frecuencia de operación: 1 KHz, 30 psi, 50 nl~0,5 µl. Controlador de válvula de 12 V: corriente de accionamiento de 2,5 A
Depósito de aire portátil de 5 galones		Coleman	Powermate CT5	Aire presurizado: 30 PSI
Reguladores de presión		Marsh Bellofram
Generador de impulsos			HP8112A	Generación de frecuencia de accionamiento: 50 MHz
Plataforma XYZ		Newmark Systems		Con motor paso a paso: plataforma XY de recorrido 6 pulgadas (NLS4-6-25), plataforma Z de recorrido 2,5 pulgadas (NLS4-2,5-25), controlador de 3 ejes (NSC-G3), resolución de 0,1 µm
NIH 3T3	Línea celular			Fibroblastos
Tripsina				Solución al 0,05 %
Medio para células NIH 3T3
DPBS	Tampón
T75				Frascos de cultivo de tejidos
Tubos cónicos de plástico				15 ml, para cultivo de tejidos