Indentación de impacto para evaluar las propiedades mecánicas del tejido cerebral de un ratón

Resumen

Fuente: Canovic, E. P., et. al., Caracterización de las propiedades mecánicas multiescala del tejido cerebral mediante microscopía de fuerza atómica, indentación de impacto y reometría. J. Vis. Exp. (2016)

El video demuestra el uso de la indentación de impacto para medir las propiedades mecánicas del tejido cerebral de un ratón hidratado, incluida la rigidez, la disipación de energía y la amortiguación, a través del análisis de desplazamiento y velocidad de la sonda.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Sangría de impacto
   1. Calibra el nanoindentador instrumentado y ajusta la configuración predeterminada para permitir experimentos de impacto dinámicos en tejidos cerebrales hidratados de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      1. Monte una sonda esférica deslizándola sobre el péndulo con pinzas.
      2. Pegue una muestra de cuarzo fundido en el poste de muestra, que se atornilla en la etapa de traslación.
      3. Vaya al menú Calibración y seleccione "Celda líquida". Siga las instrucciones del software para entrar en contacto con la muestra de cuarzo fundido.
      4. Seleccione "Normal" para el tipo de indentador y utilice el valor predeterminado de 0,05 mN para la carga del indentador. Haga clic en "Continuar" para realizar la calibración para la configuración normal del indentador.
      5. Mueva la etapa de muestra hacia atrás al menos 5 mm. Monte el brazo de palanca, que permite que la sonda se baje a la celda líquida y repita la calibración de la celda líquida en la nueva configuración seleccionando "Celda líquida" para el tipo de indentador. Haga clic en "Continuar" para obtener el factor de calibración de la celda líquida.
      6. Active la opción de software Liquid Cell yendo al menú Experimento y seleccionando "Opciones especiales". Utilice el valor de calibración más reciente.
      7. Aumente el espaciado de la placa del condensador, ya que esto conducirá a una mayor profundidad máxima medible, lo cual es necesario cuando se prueban materiales altamente compatibles.
         1. En el menú Sistema, seleccione "Configuración no protegida" y "Parámetros de la máquina" para cambiar la tasa de carga de la prueba de péndulo, la tasa de carga cero y el desplazamiento de la rampa de espera a 0,5 mN/seg, 0,1 mN/seg y 3 V, respectivamente.
         2. Con una llave, gire las tres tuercas que controlan el espaciado de la placa del condensador en el sentido de las agujas del reloj en pequeños incrementos.
         3. Después de cada giro completo en el sentido de las agujas del reloj, seleccione "Ajuste de la caja del puente" en el menú Mantenimiento y obtenga una buena prueba de péndulo, que requerirá alejar el peso del contrapeso del péndulo.
         4. Repita los pasos 1.1.7.2-1.1.7.3 hasta que la calibración de profundidad aproximada lea un valor de 70.000 nm/V o superior.
      8. Coloque un nuevo tope final de carrera en la parte inferior del péndulo que se puede encender y apagar a través de una fuente de alimentación. Retraiga el tope de límite original ubicado detrás del péndulo para eliminar una posible obstrucción del movimiento del péndulo y permitir velocidades de impacto más altas, así como profundidades de penetración más altas en muestras compatibles.
      9. Deje que el gabinete alcance el equilibrio térmico (tarda aproximadamente 1 hora).
      10. Mientras el gabinete se equilibra, regrese al menú Sistema y seleccione "Configuración no protegida" y "Parámetros de la máquina". Establezca la velocidad de contacto de calibración de profundidad (dcal) en 1 μm/seg, la velocidad de contacto de la indentación primaria en 3 μm/seg y la velocidad de contacto de carga ultrabaja en 1 μm/seg.
      11. En el menú Calibración, realice una calibración de profundidad estándar en esta nueva configuración.
      12. Encienda la fuente de alimentación del solenoide y configúrela en 10 V. Ve al menú Experimento y selecciona "Impacto" y "Ajustar desplazamiento de impulso". Siga las instrucciones del software (indicaciones automáticas) para calibrar la distancia de oscilación del péndulo.
2. Monta el tejido cerebral del ratón en la célula líquida.
   1. Después de recolectar todo el cerebro, guárdelo inmediatamente en un medio nutritivo independiente de CO₂ para medios de tejido neural adulto en hielo.
   2. Cuando la configuración de la hendidura de impacto esté completamente completa, transfiera cuidadosamente el cerebro a una placa de Petri junto con un medio independiente de CO₂. Corta el cerebro en secciones de 6 mm de grosor con superficies planas a ambos lados.
   3. Adherir el tejido en rodajas al poste de muestra de aluminio con una fina capa de adhesivo de cianoacrilato.
   4. Deslice la célula líquida sobre la segunda junta tórica del poste de muestra y llene la célula líquida con 5 ml de medio independiente de CO₂ para sumergir completamente el tejido. A continuación, este poste de muestra se monta cuidadosamente en la etapa de traslación dentro del nanoindentador instrumentado.
3. Mida la respuesta al impacto del tejido cerebral.
   1. Si es necesario, retire la sonda esférica y reemplácela con la sonda de interés sin quitar el brazo de palanca.
   2. En el menú Sistema, seleccione "Configuración no protegida" y "Parámetros de la máquina". Cambie la velocidad de contacto del impacto primario a 5 μm/seg.
   3. Con el baño de muestra bajo (dirección -z) y lejos del péndulo (dirección +x), muévase en la dirección -x hasta que la punta del brazo de palanca esté correctamente ubicada sobre el baño. Mueva en la dirección +z hasta que la punta esté completamente sumergida en el baño y frente a la muestra.
   4. Usando la ventana de control de la etapa de muestra, haga contacto con cuidado y luego retroceda la etapa lejos de la superficie de la muestra aproximadamente 30 μm.
   5. En el menú Experimento, haga clic en "Impacto" para configurar un experimento de impacto. Elija una carga de impulso específica que se relacione directamente con la velocidad de impacto resultante en función de la calibración de la distancia de giro. Ejecute el experimento programado.
   6. Cuando el péndulo oscila hacia atrás y la superficie de la muestra continúa moviéndose hacia el plano de medición, apague el interruptor de tope de límite inferior.
   7. Observe cómo el péndulo se balancea hacia adelante para impactar la muestra. El desplazamiento de la sonda en función del tiempo será registrado por el software.
   8. Cuando aparezca la ventana de la etapa xyz, vuelva a encender el interruptor de tope de límite.
   9. Repita los pasos 3.4-3.8 para probar tantas cargas y ubicaciones diferentes como sea necesario.
4. Analice el desplazamiento adquirido frente al tiempo de respuesta del péndulo utilizando scripts personalizados de MATLAB para determinar la profundidad de penetración máxima xmax, la capacidad de disipación de energía K y el factor de calidad de disipación Q.
   1. Vaya al menú Análisis y exporte los datos en un archivo de texto.
   2. Tome la derivada del tiempo del perfil de desplazamiento para obtener la velocidad en función del tiempo. Establezca el desplazamiento cero como punto de contacto xo1.
      NOTA: La velocidad de impacto vin es la velocidad máxima inmediatamente antes del contacto. xmax corresponde a la deformación en la que la velocidad de la sonda disminuye primero a cero. xo2, que equivale a xr, es la posición requerida para reiniciar el contacto con la muestra deformada en el siguiente ciclo. La velocidad de rebote vout es la velocidad al desplazamiento xr.
   3. Define K (sin unidades) como la energía disipada por la muestra normalizada por la suma de las energías de la muestra recuperadas y disipadas durante el primer ciclo de impacto. Calcule K en función de las propiedades intrínsecas del péndulo (como la rigidez de rotación y el coeficiente de amortiguación), xo1, xmax, xr, vin y vout.
   4. Dado que el desplazamiento se puede describir como un movimiento oscilatorio armónico amortiguado, ajuste una función de decaimiento exponencial a los máximos de la curva de desplazamiento frente al tiempo.
   5. Calcule Q (sin unidades) como π multiplicado por el número de ciclos necesarios para que la amplitud de la oscilación disminuya por un factor de e. Un valor más alto de Q significa una tasa de disipación de energía más baja.

Materiales