Medición de las propiedades viscoelásticas del tejido cerebral de ratón mediante reometría

Abstract

Fuente: Canovic, E. P., et al. Caracterización de las propiedades mecánicas multiescala del tejido encefálico mediante microscopía de fuerza atómica, indentación por impacto y reometría. J. Vis. Exp. (2016)

En este video, se utilizó un reómetro para aplicar un movimiento de rotación oscilatorio controlado al tejido cerebral para generar tensión de cizallamiento y evaluar las propiedades viscosas y elásticas del tejido. El reómetro, como herramienta funcional, proporciona información sobre la mecánica del cerebro durante lesiones o enfermedades neurodegenerativas.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Reología
   1. Configure y calibre el reómetro según las instrucciones del fabricante.
      1. Inicialice el reómetro abriendo el dispositivo/panel de control. En la pestaña del panel de control, haga clic en "inicializar".
      2. Monte la placa de medición de 25 mm de diámetro (PP25) y el sistema térmico.
      3. (Opcional) Para reducir el deslizamiento entre las placas del reómetro y el tejido, corte rodajas de papel de lija adhesivas que coincidan con la forma de la placa superior del reómetro y adhiera el papel de lija a la placa superior e inferior.
      4. Haga contacto entre las placas superior e inferior haciendo clic en "establecer espacio cero" en el panel de control.
      5. Ponga a cero el transductor de fuerza normal haciendo clic en "restablecer fuerza normal".
      6. Realice una prueba de inercia abriendo la pestaña de servicio en el panel de control, haciendo clic en "sistema de medición" y luego haciendo clic en "prueba de inercia". Registre la vieja y la nueva inercia. Verifique que la inercia esté dentro del límite permitido para la sonda, según lo indicado por el fabricante.
2. Cargue la muestra en el reómetro.
   1. Después de recolectar el tejido y cortar un segmento coronal del cerebro del cerdo hasta obtener un grosor de ~5 mm, guárdelo en hielo en un medio independiente del CO2.
   2. Coloque el cerebro entre las dos placas. Retire las gotas de agua grandes de la superficie superior e inferior de la muestra para evitar el deslizamiento, pero no seque la muestra.
   3. Baje lentamente la placa de medición hasta que la placa esté en contacto completo con la superficie superior del tejido y la fuerza normal medida sea constante a 0,01 mN después de un período de relajación de 5 a 10 minutos.
      1. En el panel de control, introduzca las alturas sucesivamente más bajas en el cuadro de posición de medición y haga clic en "posición de medición" para bajar lentamente la placa de medición.
      2. Cuando esté dentro de un milímetro de contacto con el tejido, baje la placa de medición en incrementos de 0,1 mm hasta que la placa esté completamente en contacto con la superficie superior del tejido. Asegúrese de que la fuerza normal medida esté constantemente en 0,01 mN después de un período de relajación de 5 a 10 minutos.
      3. Registre la fuerza normal medida inicialmente. Se deben tomar mediciones repetidas con las mismas tensiones/deformaciones de compresión.
   4. Si la muestra supera el diámetro de la placa, recórtela con una cuchilla de plástico. Pipetear un pequeño volumen (~1-2 ml) de medio en los bordes de la muestra para hidratar el tejido.
   5. (Opcional) Baje el capó térmico. En el panel de control, ajuste la temperatura a 37 °C y haga clic en "establecer".
3. Realice un barrido de amplitud para establecer el rango viscoelástico lineal del material (es decir, las deformaciones de cizallamiento a las que G' y G'' a frecuencias de interés (e.g., 1 rad/seg).
   1. Seleccione "archivo/nuevo". En la pestaña de gel, seleccione "Barrido de amplitud: Rango de LVE". Seleccione la ventana y haga clic en "Medición 1: Barrido de amplitud". Haga doble clic en el cuadro de oscilación. Introduzca la deformación inicial y final (e.g., 0.01 a 105), la frecuencia (e.g., 1 rad/seg) y el número de puntos por década (e.g., 6 puntos/dec). Seleccione "Aceptar" y haga clic en "Iniciar".
   2. Repita este procedimiento para varias rebanadas con ensayos repetidos para garantizar la consistencia del rango elástico lineal. La compresión axial de la muestra debe permanecer constante entre muestras.
4. Realice un barrido de frecuencia del tejido a una deformación en el rango viscoelástico lineal del tejido (, por ejemplo, 1% de deformación) y en un rango de frecuencia de interés (por ejemplo, 0,1-100 rad/seg).
   1. Haga clic en "archivo/nuevo" y en la pestaña de gel seleccione "Barrido de frecuencia". Haga clic en Ventana/Medición 1: Barrido de frecuencia. Haga doble clic en el cuadro de oscilación. Introduzca el rango de frecuencia (, por ejemplo, , de 0,1 a 100 rad/seg.), la deformación (, por ejemplo, , 1% de tensión) y el número de puntos por década (, por ejemplo, , 6 puntos/dec). Seleccione "aceptar" y haga clic en "Iniciar" para iniciar el barrido de frecuencia.
5. Repita el barrido de frecuencia (paso 1.4) por duplicado o triplicado.

Revise los datos que son calculados y exportados automáticamente por el reómetro: G' y G" en función de la frecuencia (barrido de frecuencia) o de la deformación cortante (barrido de amplitud). NOTA: G' y G'' se calculan a partir de la amplitud del par de reacción (máximo) de la muestra T'0, y el ángulo de desplazamiento rotacional (o ángulo de deflexión) φ°, y el φ de retraso de fase, de la respuesta de la muestra a la deformación oscilatoria aplicada (Figura 1):

donde R, y h son el radio y la altura de la muestra.

Results

Figura 1. Ilustración de experimentos con reómetros de placas paralelas. (A) Esquema del experimento de reómetro de placa paralela y definiciones relacionadas con la deformación por cizallamiento oscilatoria aplicada. (B) Deformación aplicada...

Materials