Ablación láser por espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente para visualizar metales en tejido cerebral de ratón

Resumen

Fuente: Hare, D. J., et.al. Obtención de imágenes de metales en tejido cerebral mediante ablación láser - plasma acoplado inductivamente - espectrometría de masas (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el uso de la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente por ablación láser (LA-ICP-MS) para visualizar y cuantificar las distribuciones de metales en el tejido cerebral de ratón. El protocolo implica la ablación láser para generar un aerosol de partículas de muestra, la ionización de las partículas en plasma de alta temperatura y la espectrometría de masas para separar los iones por sus relaciones masa-carga. A continuación, se utiliza un software especializado para generar imágenes cuantitativas, revelando la distribución espacial de los metales dentro del tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación de LA-ICP-MS para análisis Coloque

1. los patrones y la muestra en la cámara de ablación, asegurándose de que estén dentro de la profundidad de campo de la cámara CCD instalada en la unidad LA. Si es necesario afinar el instrumento, incluya un material de referencia adecuado (por ejemplo, NIST 612 Trace Elements in Glass). Apriete con los dedos los dos tornillos de la puerta de la cámara para sellar la cámara de ablación.
2. En el software ICP-MS, seleccione abrir la válvula de gas argón en el panel 'Mantenimiento' o similar y ajuste el flujo de gas portador a 1,2 L ^min-1 en el cuadro de diálogo correspondiente.
   NOTA: En este protocolo se utiliza argón como gas portador. Varios ejemplos utilizan helio o una mezcla de helio y argón como gas portador.
3. En el software LA, haga clic en el botón 'purgar' para lavar la celda con gas argón durante un mínimo de 30 min.
   NOTA: El tiempo de purga se puede modificar haciendo clic en un botón 'tiempo de purga' o similar. Cuando se utiliza un sistema de ablación con una célula de ablación de dos volúmenes, mueva periódicamente la platina a cada esquina y recorra diagonalmente la célula para asegurarse de que se elimine la mayor cantidad posible de aire residual de la célula. Esto se puede lograr seleccionando las "etapas de inicio" o la función equivalente.
4. Encienda el ICP-MS haciendo clic en 'plasma on' y deje calentar durante dos horas, durante las cuales se pueden realizar los pasos 1.5 - 2.4. Los ajustes de los instrumentos varían de un fabricante a otro.
5. Ablación representativa de tejidos estándares
   1. Seleccione la herramienta de línea y dibuje una sola línea de ablación de aproximadamente 3 mm de largo a través de la superficie del tejido.
   2. Establezca los parámetros de la siguiente manera haciendo clic con el botón derecho en la línea de ablación en la lista de experimentos y cambiando lo siguiente: diámetro del haz (seleccionado según corresponda por el usuario; aquí se utiliza un haz cuadrado de 30 μm), velocidad de escaneo (4 veces el diámetro del haz por segundo; 120 μm ^s-1) y fluencia de energía (0,3 -0,5 J ^cm-2 para tejidos blandos; optimice si es necesario para matrices más duras). Con un grosor de tejido de 30 μm, el rayo láser no penetra en todo el espesor de este tejido, eliminando cualquier contaminante potencial del soporte del microscopio. La normalización a carbono se puede utilizar para corregir la variación en la cantidad de tejido ablacionado. Establezca estos parámetros como predeterminados para cada línea subsiguiente seleccionando el botón de opción 'predeterminado'.
   3. Duplique esta línea seis veces seleccionando la línea inicial, haciendo clic con el botón derecho y seleccionando 'duplicar escaneos'. Asegúrese de que las líneas estén desplazadas en el eje x o y por el diámetro del haz. Esto da un total de siete líneas por patrón, espaciadas según el diámetro de la viga.
   4. Repita los pasos 1.5.1 - 1.5.3 para cada patrón, asegurándose de que la línea tenga la misma longitud.
6. Para dibujar el área de ablación sobre la muestra, siga uno de los dos métodos siguientes:
   NOTA: Asegúrese de que se utilicen los mismos parámetros de escaneo (diámetro del haz, velocidad de escaneo, fluencia de energía) para las líneas de muestreo.
   1. Si el sistema LA está equipado con un amplio campo de visión, seleccione la herramienta de línea y dibuje una línea desde la esquina superior izquierda de la muestra lo suficientemente larga como para cubrir la muestra en su punto más ancho utilizando los mismos parámetros láser descritos en 1.5. Duplique este escaneo como se describe en 1.5.3 con líneas espaciadas de acuerdo con el diámetro del haz tantas veces como sea necesario para garantizar una cobertura completa de la muestra.
   2. Si no se dispone de una vista de campo amplio, determine y registre las coordenadas x e y (normalmente mostradas en la pantalla principal como "posición del escenario" o similar) correspondientes a las esquinas de un rectángulo que cubra toda la muestra. Utilice estas coordenadas para colocar líneas paralelas de ablación que cubran toda el área de la muestra.
   3. Traza líneas para el escaneo intermitente de patrones a más tardar después de ~20 h de escaneo de la muestra repitiendo el proceso descrito en 1.5. Dependiendo de la duración del escaneo de la muestra, esto puede ser necesario varias veces. Finalice el experimento con un escaneo adicional de los estándares.
      NOTA: Al determinar las coordenadas x e y mientras se purga la celda, la selección de las posiciones de inicio y la calibración asociada del eje cambiará las especificaciones previamente adquiridas para las coordenadas x e y, mientras que la diferencia (es decir, la longitud de la línea) no se verá afectada.

2. Configuración de métodos de adquisición de datos para el ICP-MS

1. Para la línea estándar de ablación, divida la longitud de la línea por la velocidad de escaneo láser para determinar el tiempo total de análisis para una sola línea. Repita esto para la línea de muestreo.
2. En el software ICP-MS, cree un nuevo método (que se muestra aquí como un 'lote') y asegúrese de que se haya seleccionado 'análisis resuelto en el tiempo' o equivalente. Seleccione los valores m/z que se van a detectar y, a continuación, ajuste el tiempo de integración para cada m/z para que el tiempo total de integración de un ciclo sea igual a 0,25 s. Haga clic en 'Guardar lote como' y asigne el nombre correspondiente (por ejemplo, Std1).
   NOTA: Como la muestra atravesará el rayo láser a cuatro veces el diámetro del haz, esto garantiza que se registre un punto de datos para cada masa equivalente al diámetro del haz. Por ejemplo, si se utiliza un tamaño de punto de 100 μm, una velocidad de escaneo de 400 μm ^s-1 con un tiempo de integración de 0,25 s producirá imágenes con tamaños de píxel reales. El tiempo de integración se puede ajustar para mejorar la sensibilidad; Al aumentar el tiempo de integración a 0,33 s, la velocidad de escaneo debe reducirse a tres veces el diámetro del haz.
3. Para los estándares, ingrese el tiempo de análisis para cada escaneo de línea en el cuadro correspondiente, más 15 s adicionales para tener en cuenta los tiempos de calentamiento y lavado del láser. Introduzca una lista de ejecución de ejemplo (es decir, el orden en el que se ejecutan los exámenes) con el mismo número de adquisiciones (normalmente numeradas secuencialmente; es decir, 001, 002, etc.) como el número total de líneas estándar.
4. Para la muestra, duplique el método utilizado para los estándares guardando el método o lote actual con un nombre de archivo alternativo, y ajuste el tiempo total de adquisición (incluidos los 15 s adicionales) y el número total de adquisiciones para que coincida con el número de líneas que ablacionarán la muestra.
   NOTA: Como la mayoría de los sistemas LA-ICP-MS utilizan un disparador unidireccional (los disparadores LA ICP-MS), es esencial que el software ICP-MS esté esperando el disparo de la AI antes de que comience la siguiente línea de ablación. En la ventana de adquisición de ICP-MS se leerá 'esperando el inicio'.

3. Ejecución del experimento

1. Inicie la cola ICP-MS agregando el primer método o lote a la cola y asegúrese de que el software esté esperando el disparador del sistema LA.
2. En el software LA, habilite la fuente de alimentación del láser haciendo clic en 'emisión', haga clic en 'ejecutar' y configure el tiempo de calentamiento del láser en 10 s y el tiempo de lavado en 20 s en las casillas correspondientes.
   NOTA: Este exceso asegurará que el ICP-MS esté listo para comenzar a adquirir nuevos datos cuando el láser comience cada línea subsiguiente de ablación.
3. Inicie la secuencia láser haciendo clic en 'iniciar'. Si utiliza una celda de dos volúmenes, asegúrese de que el recipiente de muestra esté en su posición.

4. Cálculo de los estándares de cuantificación

NOTA: Existen múltiples variaciones para convertir los datos ICP-MS en imágenes. Estos incluyen el uso de herramientas de software caseras escritas en lenguajes de código abierto, macros comerciales y software de análisis de datos. Aquí, utilice el complemento de software recientemente desarrollado, basado en una suite especializada en análisis de datos LA-ICP-MS.

1. Transfiera todas las carpetas de lotes que contienen los datos de ejecución (001.d, 002.d, etc.) a un ordenador independiente con el software de análisis instalado. Extraiga los archivos de datos *.csv para cada línea del lote en una carpeta separada.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente usar un script para transferir automáticamente los archivos *.csv a una nueva carpeta. Consulte el código Python adjunto para obtener más detalles. Este script ha sido escrito para adaptarse a un ICP-MS de la serie 7700 o 8800 de Agilent, pero se puede editar para que se adapte al archivo de salida de otros fabricantes.
2. Abra la plataforma de software y siga las pestañas secuencialmente para importar y analizar los estándares para producir imágenes cuantitativas como se describe a continuación.
3. Para importar los datos del primer lote estándar, seleccione 'Agilent .csv' para 'Tipo de archivo', 'Carpeta completa' para 'Tipo de importación' y compruebe que el 'Formato de fecha' sea idéntico al formato de la computadora. Haga clic en 'Importar', seleccione la carpeta que contiene los archivos de .csv para el primer conjunto de estándares y vaya a la pestaña 'Líneas base'.
4. Resta de referencia
   1. Utilice la pestaña 'Selecciones automáticas' (comando 2) del menú desplegable principal de la aplicación en la barra de herramientas, seleccione 'Información de la importación' y haga clic en 'Continuar'.
   2. Haga clic en 'Seleccionar todo' y seleccione 'Baseline_1' para la integración.
   3. Para seleccionar los primeros 10 s de cada línea de escaneo (correspondientes al tiempo de calentamiento del láser), recorte los datos introduciendo los segundos valores '0' y '(duración de la línea - 10 s)' y haga clic en 'Añadir integraciones' (por ejemplo, para una línea de escaneo de 35 s, introduzca los valores '0' y '25').
5. Para seleccionar los datos de muestra, utilice la pestaña "Selecciones automáticas" como se describe en 4.4, pero elija "Output_1" como integración. Recorte los datos desde el principio y el final de cada línea estándar para excluir la señal de fondo (por ejemplo, para una línea de exploración de 35 s, introduzca los valores '13' y '4').
6. Para excluir las caídas en la señal causadas por posibles agujeros en los estándares, en la pestaña 'Muestras', haga clic en 'Canales' en la parte superior izquierda del área del gráfico para seleccionar un canal con una alta relación señal/ruido (por ejemplo, C13 o P31). Tome nota de cualquier caída brusca en la señal y seleccione un valor de CPS lo suficientemente bajo como para estar por debajo de la variación normal dentro de las muestras, pero lo suficientemente alto como para detectar las caídas bruscas en la señal.
7. Haga clic en la pestaña 'DRS' y seleccione 'Baseline_Subtract' para el 'Esquema de reducción de datos actual'. Elija el canal de 4.6 para 'Canal de índice' y el valor CPS para 'Umbral para usar al enmascarar señales bajas'. Insértese un valor <0,5 s para "Segundos para recortar antes/después de las señales bajas" para tener en cuenta el retraso en la transferencia de señal del láser al ICP-MS.
8. Para confirmar el enmascaramiento adecuado de las áreas de señal baja, haga clic de nuevo en la pestaña 'Muestras' y seleccione una traza de canal procesada (por ejemplo, Fe56_CPS). Repita y perfeccione los valores de CPS y 'Segundos para recortar antes/después de las señales bajas' como en 4.7 si es necesario.
9. Haga clic en la pestaña 'Resultados' y elija 'Exportar datos' en el menú desplegable principal de la aplicación. Introduzca un nombre de archivo para generar un archivo de datos de hoja de cálculo de los resultados (por ejemplo, cálculos Std1, Std2...).
10. Abra el archivo de datos en un programa de hoja de cálculo adecuado y calcule los valores de CPS para cada canal individual que se va a cuantificar. Utilice las concentraciones de metal predeterminadas de la nebulización en solución ICP-MS para calcular el factor de conversión de valores de CPS a ppm (μg g⁻¹) para cada elemento cuantificable.
11. Repita los pasos 4.3 a 4.10 para todos los conjuntos de normas de la ejecución.

5. Construcción de imágenes cuantitativas

1. Escriba 'Biolite()' en el símbolo del sistema para abrir el software.
2. Importe los datos de muestra haciendo clic en 'Cargar imágenes' y seleccionando la carpeta que contiene los archivos de .csv para la imagen de muestra.
3. Corrección de fondo
   1. Haga clic en la pestaña 'Líneas de base' para aplicar la corrección de fondo para la muestra. En la imagen de fósforo (P31) que aparece en la pantalla, seleccione áreas del fondo con la herramienta de dibujo de rectángulo. Al seleccionar tantas regiones como sea posible, se crea un mapa de toda la imagen de la deriva de la señal/plasma para garantizar una compensación adecuada de estos factores de confusión.
   2. Para hacer que la señal de fondo sea más visible, seleccione la herramienta de edición de gráficos (arriba a la izquierda de la imagen mostrada) y haga clic con el botón derecho en la imagen. Seleccione 'Modificar la apariencia de la imagen' y cambie el 'Primer color en Z=' a un valor negativo grande (por ejemplo, -100,000). Proceda haciendo clic en 'Listo'.
4. Haga clic en la pestaña "Estándares" para que aparezca una tabla de factores de corrección CPS/ppm. Introduzca los valores calculados a partir de las normas del paso 4.10 para cada uno de los elementos. Este paso ayudará a corregir la deriva de sensibilidad en el ICP-MS. Haga clic en 'Ir!'
5. Abra el 'Navegador de datos' desde la pestaña 'Datos', que contiene las imágenes de cada elemento y cada paso.
6. Para finalizar una imagen para la exportación, seleccione la imagen deseada en la carpeta 'StdCorrImages', haga clic con el botón derecho en el nombre de la imagen (*_ppm) y haga clic en 'NewImage'. Haga clic con el botón derecho en la imagen para abrir 'Modificar apariencia de imagen' para elegir la tabla de colores y la escala de colores deseadas. Agregue una escala de color a la imagen haciendo clic con el botón derecho en la imagen y seleccionando 'Agregar anotación'. Seleccione 'Escala de colores' en el menú desplegable de la parte superior izquierda y use las pestañas para modificar la escala de colores deseada.
7. Para exportar una imagen, asegúrese de que la imagen en cuestión esté seleccionada y vaya a la pestaña 'Archivo' y haga clic en 'Guardar gráficos...'. Seleccione el formato deseado y guarde la imagen. Alternativamente, la imagen seleccionada se puede transferir utilizando las herramientas de copiar y pegar.
8. Repita los pasos 5.6 y 5.7 para todas las imágenes de interés.
9. activar las herramientas >de ROI, vaya a la pestaña 'Análisis', 'Paquetes' y seleccione 'Procesamiento de imágenes'.
10. Seleccione la imagen deseada y navegue hasta la pestaña 'Imagen' y haga clic en 'ROI...'. Haga clic en "Iniciar sorteo de ROI" y utilice una herramienta de dibujo para seleccionar una región de interés en la muestra. Para terminar el dibujo, haga clic en 'Finalizar ROI'.
11. Para obtener las estadísticas del ROI seleccionado, vaya a la pestaña 'Imagen' y haga clic en 'Estadísticas...'.
12. Copie y pegue los resultados en una hoja de cálculo separada. Repita la selección de ROI (5.9.2) para todas las regiones y elementos de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Portaobjetos de microscopio de vidrio de soda	n/a	n/a	Los portaobjetos típicos son adecuados para todos los experimentos
NWR213 Sistema de ablación láser	ESI Ltd	n/a	Utilizados en estos experimentos. Otros fabricantes adecuados, pueden requerir modificaciones en el protocolo
Agilent 8800 Series ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Utilizado en estos experimentos. Otros fabricantes adecuados, pueden requerir modificaciones al protocolo
Iolite	Iolite Software	n/a	Disponible en http://iolite-software.com/. Hay otros métodos disponibles, véase el protocolo
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	Disponible desde https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm