Imágenes de segunda generación de armónicos en un modelo de rata para estudiar defectos de tubulina

Resumen

Fuente: Piazza, V., et al., Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en la mielina central. J. Vis. Exp. (2023)

Este video demuestra el procedimiento para obtener imágenes de anomalías de microtúbulos en un corte de tejido cerebral de rata utilizando un microscopio de excitación de dos fotones. Emplea señales de generación de segundos armónicos (SHG) para detectar defectos de tubulina y reducir la producción de mielina.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Transfiera al microscopio

1. Si el microscopio está en una habitación diferente, prepare una caja aislada con paquetes de gel calentado para transferir las secciones de tejido mientras se mantiene la temperatura. La caja también mantendrá las secciones calientes hasta que se obtengan imágenes.
2. Coloque la muestra bajo el microscopio y asegúrese de que esté colocada correctamente debajo del objetivo mediante la observación directa a través de los oculares con luz transmitida.
   NOTA: El objetivo es alinear las estructuras emisoras predichas con la dirección de oscilación del láser para maximizar la señal de generación de segundos armónicos (SHG) emitida (y, por lo tanto, detectada).
3. Retire el exceso de HBSS de modo que una fina película líquida cubra toda la muestra. Revise visualmente la película líquida cada pocos minutos para evitar la evaporación y el secado excesivos de la muestra.
   NOTA: En las condiciones descritas, se utiliza una sección durante no más de 20 minutos. El secado de la muestra provoca efectos artefactuales drásticos (Figura 1A). Si se necesitan tiempos de imagen más largos, se recomienda remojar periódicamente la sección en un medio cálido y fresco en lugar de agregar más HBSS. También se recomienda el uso de cámaras de perfusión y pegamento o agarosa de bajo punto de fusión para inmovilizar el tejido cuando se van a realizar experimentos más largos.
4. Prepare la etapa del microscopio para la obtención de imágenes no desescaneadas, lo que puede incluir cerrar todas las puertas de la cámara de incubación oscura o cubrir la cámara de incubación con una tela recubierta de poliuretano de nailon negro.

2. Imágenes

1. Seleccione el modo de imagen "no escaneado" a lo largo de la ruta de transmisión. De esta manera, se optimizará la captura de la señal SH débil de la tubulina.
2. Seleccione el objetivo LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. Establezca una potencia láser entre 13 mW y 26 mW, con un tiempo de permanencia de píxeles de 12,6 μs. Tome imágenes de no más de 512 píxeles x 512 píxeles, con una velocidad de 5 y un promedio de 2, para un tiempo de adquisición promedio de aproximadamente 15 s.
   NOTA: El uso de potencias láser más altas y/o tiempos de permanencia más largos puede dañar la muestra (Figura 1B).
4. Tome imágenes primero con un filtro de paso corto de 485 nm (SP485) y, en un segundo paso, agregue un filtro de paso de banda nítido de 405 nm (BP405; Figura 2).
   NOTA: Las imágenes de pseudo-campo claro se pueden tomar a través del mismo detector utilizando la luz láser residual de una línea visible (los láseres de 405 nm o 488 nm funcionan mejor).

Resultados

Figura 1: Ejemplos de artefactos. (A) Artefacto debido al secado de la muestra. (B) Artefacto debido a una exposición excesiva. Barras de escala: 30 μm.

Materiales