Imágenes confocales de lapso de tiempo de la dinámica dendrítica neuronal en explantes de retina de ratón

Resumen

Fuente: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el uso de la microscopía confocal para visualizar la dinámica dendrítica en explantes de retina de ratones vivos. Describe los pasos para estabilizar la retina bajo un microscopio confocal, realizar imágenes de epifluorescencia para visualizar las interneuronas amacrinas con estallidos estelares y capturar imágenes 3D de lapso de tiempo para monitorear los cambios en la morfología dendrítica amacrina.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Imágenes confocales de lapso de tiempo de preparaciones de retina de montaje completo en vivo

1. Ensamble la cámara de incubación de imágenes en vivo para un microscopio confocal vertical, como se ve en Figura 1.
   NOTA: Para los sistemas confocales invertidos, las monturas planas se colocan con las células ganglionares de la retina (RGC) hacia abajo directamente sobre el cubreobjetos del fondo de vidrio de la cámara de incubación. Una vez que las retinas entran en contacto con el cubreobjetos, no se pueden mover.
2. Llene la cámara con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (aCSF) y encienda la bomba y el controlador de temperatura (temperatura 32-34 °C, caudal 1 mL/min). No permita que la temperatura suba por encima de los 34 °C.
3. Para transferir el monoplaza de retina a la cámara de perfusión, detenga la bomba y retire el líquido cefalorraquídeo que se encuentra en la cámara. Coloque el disco de éster de celulosa mixto (MCE) con el retinal de montaje plano en la cámara de incubación (vacía).
4. Coloque una pesa de muestra en el montaje plano; Humedece previamente el peso para romper la tensión superficial. Vuelva a llenar la cámara con el aCSF calentado y haga circular el aCSF a ~1 mL/min.
5. Coloque el revólver con el objetivo de inmersión en agua 25x (apertura numérica 0.95) en la cámara de imágenes. Cribado de las células marcadas de interés utilizando luz epifluorescente (Figura 1C).
6. Ajuste el volumen de la imagen para capturar las características dendríticas de interés.
   NOTA: Este estudio capturó el eje dendrítico completo a 1024 x 1024 píxeles por fotograma, paso z de 1 μm, y una velocidad de fotogramas de 2 minutos entre cada pila z. Los tamaños finales de las imágenes son ~100 μm x 100 μm x 20 μm.
7. Para ajustar la potencia del láser a una configuración óptima, utilice una tabla de búsqueda que identifique tanto los píxeles sobresaturados como los subsaturados. Durante el escaneo, ajuste la potencia del láser de modo que no haya píxeles sobresaturados (es decir, a una intensidad de 255 o superior). Continúe tomando imágenes todo el tiempo que sea necesario o hasta que haya una disminución significativa y detectable en la señal fluorescente y un aumento en el ruido (generalmente de 2 a 4 h).
   NOTA: Se recomienda reducir la potencia del láser, ya que los algoritmos de deconvolución funcionan de manera óptima cuando los píxeles se distribuyen en todo el rango dinámico. La intensidad de píxeles no debe exceder los 254; Los análisis empíricos de las neuritas revelaron que los valores de píxel por debajo de 170 son ideales para la deconvolución. Las velocidades de escaneo rápidas (400-600 Hz) con promedio de línea (2-3) son preferibles a los escaneos únicos y más lentos del mismo tiempo total de permanencia de píxeles. El área de imágenes prolongadas a menudo se fotoblanquea, pero otras secciones de explantes siguen siendo viables. Se pueden obtener imágenes de múltiples regiones en un montaje plano, cada una durante 2-4 h, con un tiempo total de incubación de 6 horas. Las sesiones de imagen de más de 6 h no se han probado sistemáticamente. La degradación de las neuritas y la formación de ampollas son signos de que la viabilidad del explante está disminuyendo.

Resultados

Figura 1: Configuración de la cámara de incubación de imágenes de células vivas. (A) Aparato de incubación de imágenes en vivo que muestra componentes de calentamiento, solución e imágenes. El calentador doble incluye una plataforma de cámara...

Materiales