Imagen y cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas

Resumen

Fuente: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultivo de neuronas ganglionares retinianas de rata axotomizadas con glia envolvente olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra la obtención de imágenes y la cuantificación de la regeneración axonal en neuronas ganglionares de la retina de rata axotomizadas (RGN) co-cultivadas con células gliales de envoltura olfativa humanas inmortalizadas. Las RGN están inmunomarcadas, con somas rojos y axones verdes. Las imágenes se capturaron con un microscopio de epifluorescencia y el porcentaje de neuronas con un axón y un índice de regeneración axonal se cuantificaron mediante un software de imagen.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Glia de envoltura olfativa humana (ihOEG, Ts12 y Ts14) cultivo

NOTA: Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en una cabina de bioseguridad para cultivo de tejidos.

1. Prepare 50 mL de medio de cultivo ME10 OEG.
2. Prepare 5 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium o DMEM/F12-Fetal Bovine Serum (FBS), en un tubo cónico de 15 mL.
3. Calentar ambos medios a 37 °C en un baño de agua limpia durante 15 min.
4. Descongele los viales de células Ts12 y Ts14 a 37 °C en un baño de agua limpia.
5. Vuelva a suspender y agregue las células al medio de cultivo DMEM/F12-FBS preparado en el paso 2.
6. Centrifugar durante 5 min a 200 x g.
7. Aspire el sobrenadante.
8. Añadir 500 μL de medio ME10 y volver a suspender el pellet.
9. Prepare una placa de cultivo celular p60 con 3 mL de ME10 y agregue la suspensión celular gota a gota.
10. Mueva para distribuir las celdas de manera uniforme por el plato.
11. Cultivo de células a 37 °C en CO₂.
    NOTA: Después de alcanzar la confluencia, se debe hacer al menos otro paso para optimizar las células para el cocultivo. Se necesita un 90% de confluencia antes de sembrarlos en los cubreobjetos para el cocultivo. Un p-60 confluente tiene un número medio de celdas de 7 x 10⁵ para Ts14 y 2,5 x 10⁶ para las líneas celulares Ts12. Las líneas celulares Ts12 y Ts14 deben pasar cada 2-3 días.

2. Preparación de ihOEG (Ts12 y Ts14) para el ensayo

NOTA: Este paso debe realizarse 24 horas antes de la disección y el cocultivo de las neuronas ganglionares de la retina (RGN).

1. Trate los cubreobjetos de 12 mm de Ø con 10 μg/mL de poli-L-lisina (PLL) durante 1 h.
   NOTA: Los cubreobjetos se pueden dejar toda la noche en la solución de PLL.
2. Lave los cubreobjetos con 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) tres veces.
3. Separe las células ihOEG Ts12 y Ts14 de la placa de cultivo celular p60.
   1. Añada 4 mL de medio de cultivo DMEM/F12-FBS a un tubo cónico de 15 mL. Calentar a 37 °C en un baño de agua limpia.
   2. Retire el medio de las placas y lave las células una vez con 1 mL de 1x PBS-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
   3. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA a las células OEG e incubar durante 3-5 min a 37 °C, 5% de CO₂.
   4. Recoja las células con una pipeta p1000 y transfiérelas al medio preparado en el paso 3.1.
   5. Centrifugar durante 5 min a 200 x g.
   6. Aspire el sobrenadante.
   7. Agregue 1 mL de medio ME10 y vuelva a suspender el pellet.
   8. Cuente el número de células en un hemocitómetro.
4. Siembre 80.000 células Ts14 o 100.000 células Ts12/pocillo en los cubreobjetos en placas de 24 pocillos en 500 μL de medio ME10.
5. Cultivo de células a 37 °C en CO₂ durante 24 h.

3. Disección de tejido retiniano

NOTA: Se utilizan ratas Wistar macho de 2 meses de edad como fuente de RGN. Dos retinas (una rata) para 20 pocillos de una placa de celdas de 24 pocillos. Autoclave de material quirúrgico antes de su uso. El kit de disociación de papaína se compra comercialmente (Tabla de materiales). Siga las instrucciones del proveedor para la reconstitución. Reconstituya el ácido D, L-2-amino-5-fosfonovalérico (APV) en un caldo de 5 mM y prepare las alícuotas.

1. El día del ensayo, prepare los siguientes medios.
   1. Prepare una placa de cultivo celular p60 con 5 mL de solución salina equilibrada fría de Earle's o EBSS (vial 1 del kit de disociación de papaína).
   2. Prepare una placa de cultivo celular p60 con el vial reconstituido 2 (papaína) del kit de disociación de papaína más 50 μL de APV. A continuación, añadir 250 μL de vial reconstituido 3 (DNasa más 5 μL de APV).
   3. En un tubo estéril, mezclar 2,7 mL del vial 1 con 300 μL del vial 4 (inhibidor de la proteasa albúmina-ovomucoide). Añadir 150 μL de vial 3 (DNasa) más 30 μL de APV.
   4. Prepare 20 mL de medio Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Sacrifica una rata por asfixia con CO₂.
3. Extirpar la cabeza por decapitación con una guillotina; colóquelo en una placa de Petri de 100 mm y rocíe la cabeza con etanol al 70% antes de colocarlo en una campana de flujo laminar.
4. Corta los bigotes de la rata con unas tijeras para que no interfieran con la manipulación del ojo.
5. Agarre el nervio óptico con pinzas para extraer el globo ocular lo suficiente como para poder hacer una incisión en el ojo con un bisturí.
6. Retire el cristalino y el humor vítreo y extraiga la retina (tejido anaranjado), mientras que las capas restantes del ojo permanecen en el interior (incluida la capa epitelial pigmentaria).
7. Coloque la retina en la placa de cultivo celular p60 preparada en el paso 3.1.1.
8. Transfiera la retina a la placa de cultivo celular p60 preparada en el paso 3.1.2 y córtela con el bisturí en trozos pequeños de tamaño aproximado < 1 mm.
9. Transfiera a un tubo de plástico de 15 mL.
10. Incubar el tejido durante 30 min en una incubadora humidificada a 37 °C bajo un 5% de CO₂, con agitación cada 10 min.
11. Disocie los grupos de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur de vidrio.
12. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min.
13. Deseche el sobrenadante y, para inactivar la papaína, vuelva a suspender la pastilla celular en la solución preparada en el paso 3.1.3. (1,5 mL para 2 ojos).
14. Pipetear cuidadosamente esta suspensión celular en 5 mL de vial reconstituido 4.
15. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
16. Mientras centrifuga, retire completamente el medio ME-10 de la placa de celda OEG de 24 pocillos (previamente preparada en el paso 2) y reemplácela con 500 μL de medio NB-B27 por pocillo.
17. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mL de medio NB-B27.
18. Placa de 100 μL de suspensión de células de retina, por pocillo de la placa m24, sobre cubreobjetos monocapas tratados con PLL o OEG.
19. Mantener los cultivos a 37 °C con 5% de CO₂ durante 96 h en medio NB-B27.

4. Inmunotinción

1. Después de 96 h, fije las células durante 10 min añadiendo el mismo volumen de paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x PBS al medio de cultivo (600 μL) (concentración final de PFA 2%).
2. Retire el medio y el PFA de la placa de 24 pocillos múltiples y vuelva a añadir 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x PBS. Incubar durante 10 min.
3. Deseche el fijador y lave 3 veces con 1x PBS durante 5 min.
4. Bloquee con 0.1% Triton X-100/1% FBS en PBS (PBS-TS) durante 30–40 min.
5. Prepare los anticuerpos primarios en el tampón PBS-TS de la siguiente manera: Anticuerpo monoclonal SMI31 (contra las proteínas MAP1B y NF-H) (1:500). 514 (reconoce las proteínas MAP2A y B) antisuero policlonal de conejo (1:400).
6. Agregue los anticuerpos primarios a los cocultivos e incube durante la noche a 4 °C.
7. Al día siguiente, deseche los anticuerpos y lave los cubreobjetos con 1x PBS, 3 veces, durante 5 min.
8. Prepare los anticuerpos secundarios en el tampón PBS-TS de la siguiente manera: Para SMI-31, anti-ratón Alexa Fluor 488 (1:500). Para 514, Alexa-594 anti-conejo (1:500).
9. Incubar las células con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes durante 1 h, a temperatura ambiente o RT en la oscuridad.
10. Lave los cubreobjetos con 1x PBS, 3 veces, durante 5 min, en la oscuridad.
11. Finalmente, monte los cubreobjetos con medio de montaje (Tabla de materiales) y manténgalos a 4 °C.
    NOTA: Siempre que sea necesario, se puede realizar la tinción de núcleos fluorescentes con DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol). Antes de montar, incubar las células durante 10 minutos en la oscuridad con DAPI (10 μg/mL en 1x PBS). Lave los cubreobjetos 3 veces con 1x PBS y, por último, monte los cubreobjetos con el medio de montaje.

5. Cuantificación de la regeneración axonal

NOTA: Las muestras se cuantifican bajo el objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia. Se deben tomar un mínimo de 30 imágenes en campos aleatorios, con al menos 200 neuronas, que se cuantificarán para cada tratamiento. Cada experimento debe repetirse un mínimo de tres veces.

1. Cuantificar el porcentaje de neuronas con axón (nerita positiva para SMI31) en relación con la población total de RGN (identificadas con inmunotinción positiva para MAP2A/B 514 del cuerpo neuronal y las dendritas).
2. Cuantificar el índice de regeneración axonal o longitud axonal media (μm/neurona). Este parámetro se define como la suma de las longitudes (en μm) de todos los axones identificados, dividida por el número total de neuronas contadas, tanto si presentaban un axón como si no. La longitud axonal se determina utilizando el plugin NeuronJ del software de imagen ImageJ (NIH-USA).
3. Calcule la media, la desviación estándar y la significación estadística utilizando el software adecuado.

Materiales