Obtención de imágenes celulares mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total

Abstract

Fuente: Daniele, F., et. al TIRFM y sondas GFP sensibles al pH para evaluar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma SH-SY5Y: imágenes celulares y análisis de datos. J. vis. exp. (2015).

Este video muestra la obtención de imágenes de células de neuroblastoma humano utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas con fluoróforos. Las células se enfocan primero en modo de epifluorescencia. A continuación, se realizan ajustes para lograr una reflexión interna total, generando ondas evanescentes que excitan selectivamente los fluoróforos cerca de la membrana. Antes de la obtención de imágenes TIRF, se configuran los parámetros de adquisición y se establece la frecuencia de muestreo.

Protocol

1. Cultivo celular y transfección

1. SH-SY5Y cultivo celular
   NOTA: Los experimentos se han realizado utilizando el neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Las células SH-SY5Y crecen como una mezcla de grupos flotantes y células adherentes. Siga las instrucciones informadas en el protocolo (densidad celular, relación de división, etc.) para que las células crezcan firmemente adheridas a la cubierta de vidrio, lo cual es crucial para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM).
   1. Antes de comenzar, bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, haga el volumen oportuno de so....

Results

Figura 1. Configuración del microscopio TIRF. Vista esquemática e imagen (recuadro) del sistema de microscopio TIRF. La configuración comprende el microscopio invertido motorizado Axio Observer Z1 (A), un láser de iones de argón (B) multilí.......

Materials