Obtención de imágenes celulares mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total

Abstract

Fuente: Daniele, F., et. al TIRFM y sondas GFP sensibles al pH para evaluar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma SH-SY5Y: imágenes celulares y análisis de datos. J. vis. exp. (2015).

Este video muestra la obtención de imágenes de células de neuroblastoma humano utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas con fluoróforos. Las células se enfocan primero en modo de epifluorescencia. A continuación, se realizan ajustes para lograr una reflexión interna total, generando ondas evanescentes que excitan selectivamente los fluoróforos cerca de la membrana. Antes de la obtención de imágenes TIRF, se configuran los parámetros de adquisición y se establece la frecuencia de muestreo.

Protocol

1. Cultivo celular y transfección

1. SH-SY5Y cultivo celular
   NOTA: Los experimentos se han realizado utilizando el neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Las células SH-SY5Y crecen como una mezcla de grupos flotantes y células adherentes. Siga las instrucciones informadas en el protocolo (densidad celular, relación de división, etc.) para que las células crezcan firmemente adheridas a la cubierta de vidrio, lo cual es crucial para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM).
   1. Antes de comenzar, bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, haga el volumen oportuno de solución salina de tampón de fosfato estéril (PBS) y medio de cultivo.
      1. Prepare 50 ml de PBS con concentraciones de 150 mM de cloruro de sodio (NaCl), 24 mM de tampón de fosfato, pH 7,4. Filtra la solución.
      2. Prepare 50 ml de medio celular a partir del medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa, 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml), L-glutamina (2 mM) y piruvato de sodio (1 mM). Filtra la solución.
   2. Retire todo el medio de crecimiento y lave las células con 3 ml de PBS.
   3. Incubar las células con 2 ml de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05% (para una placa de Petri de 6 cm) durante 5 min a 37 °C, 5% de CO₂ y separar las células con una pipeta.
   4. Inactivar la tripsina añadiendo 2 ml de DMEM y recoger las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min.
   5. Retire el sobrenadante, agregue 1 ml de DMEM al pellet y pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo lo suficiente como para dispersar las células en una suspensión unicelular.
   6. Divídalos 1:4 en una nueva placa de Petri de 6 cm de diámetro que contenga 3 ml de medio completo. Mantener las células en cultivo en placas de Petri de 6 cm de diámetro a 37 °C en una incubadora de 5% de_CO2. Subcultivo una vez a la semana, o cuando hayan cubierto el 80 - 90% de la superficie.
2. Recubrimiento de células SH-SY5Y para imágenes
   1. Para los experimentos TIRF, las células de placa se colocan sobre cubiertas de vidrio. Emplee cubiertas de vidrio con un espesor de 0,17 ± 0,005 mm y un índice de refracción de 1,5255 ± 0,00015. Antes de comenzar, prepare las fundas de vidrio de la siguiente manera:
      1. Limpie las cubiertas de vidrio con etanol al 90% durante la noche (O/N).
      2. Enjuágalos bien con agua destilada (tres cambios de agua destilada). Seque las cubiertas de vidrio en un horno de secado.
      3. Coloque las tapas en placas de Petri de vidrio y esterilice en un horno precalentado a 200 °C durante 3 horas.
   2. El día antes de la transfección, coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 3,5 cm, añada 1 ml de medio de cultivo e incube a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5%.
   3. Tripsinar las células como se describe en los pasos 1.1.3 - 1.1.5, suspender el pellet de células en 1 ml de medio completo y contar. Calcule el volumen correcto de suspensión celular para agregar a cada placa de Petri para producir 3 x 10⁵ celdas/pocillo. Esta densidad es necesaria para un crecimiento celular óptimo y una transfección eficiente. Incubar a 37 °C en una incubadora O/N con 5% de CO₂.
3. SH-SY5Ytransfección por polietilenimina (PEI)
   NOTA: Para visualizar la dinámica de las vesículas sinápticas, se ha utilizado un vector pCB6 que contiene sinapto-pHluorina. La sinapto-pHluorina se ha generado por fusión en el marco de una variante sensible al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) y la proteína de membrana vesicular sinaptobrevina 2. El constructo se ha empleado ampliamente para investigar las propiedades de las vesículas sinápticas dentro de las neuronas.
   1. Antes de comenzar la transfección, prepare 10 ml de las siguientes soluciones. Conserve las soluciones durante un máximo de 1 mes.
      1. Haz una solución de NaCl de 150 mM. Ajuste a pH 5.5 con ácido clorhídrico (HCl) 0.01 N.
      2. Hacer una solución de PEI al 10% de polietilenina (PEI; 25 kDa lineal) en una solución de NaCl de 150 mM. El pH de la solución se eleva a 8,8. Ajuste el pH a 7,8 con 0,01 N HCl.
   2. 24 horas después del enchapado, retire el medio y refresque con 1,5 ml de medio completo. Mantenga las células a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂.
   3. Debajo de la cabina de bioseguridad de flujo laminar, en un tubo de microfuga de 1,5 ml, agregue 3 μg de ADN plasmídico a 25 μl de solución de NaCl de 150 mM y 100 μl de solución de PEI por placa de Petri de 3,5 cm.
   4. Vértice durante 10 segundos, luego incube la mezcla de ADN/PEI durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
   5. Agregue con cuidado la mezcla de ADN/PEI a la placa de Petri que contiene cubreobjetos con células y agite suavemente para distribuir uniformemente el reactivo en la placa de Petri.
   6. Después de 4 h, cambie el medio e incube las células O/N a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂. Realizar experimentos de imagen 24 - 48 h después de la transfección.

2. Imágenes celulares por TIRFM

1. Imaging set-up
   1. Realice imágenes TIRF con la configuración descrita en la Figura 1. Consta de un microscopio invertido motorizado (Figura 1, recuadro A), la fuente láser (Figura 1, recuadro B) y el deslizador TIRF (Figura 1, recuadro C). Alcance la iluminación TIRFM a través de un aceite 100X de alta apertura numérica (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar), objetivo de inmersión.
   2. Para la iluminación TIRF, emplee un láser de iones de argón multilínea (458/488/514 nm) de 100 mW. Usando una fibra monomodo, introduzca la luz láser polarizada linealmente en la trayectoria del haz a través del control deslizante TIRF. Inserte el control deslizante TIRF en el plano del diafragma de campo luminoso de la trayectoria del haz de luz reflejada.
      1. Para iluminación de campo amplio, conecte el microscopio a una lámpara de arco corto de mercurio convencional HBO de luz blanca. Un prisma doble que mantiene la polarización en el control deslizante garantiza la combinación simultánea de iluminación TIRF y luz blanca.
   3. Filtre la luz láser con un filtro de excitación (ancho de banda 488/10 nm) montado en una rueda de filtros e introducido en la trayectoria del láser. Emplee un obturador de alta velocidad controlado por software para permitir un control rápido de la iluminación láser. Para el análisis de pHluorin, monte un filtro de emisión de paso de banda de 525/50 nm. Capture imágenes digitales (512 x 512 píxeles) en una cámara Fast CCD refrigerada con el software Image ProPlus.
2. Lograr la iluminación TIRF (Figura 2)
   1. Encienda los láseres, la computadora, la cámara, la rueda de filtros y los controladores del obturador; luego, espere 20 minutos antes de comenzar el experimento, ya que los láseres necesitan calentarse y estabilizarse.
   2. Antes de la toma de imágenes, haga el volumen oportuno de las siguientes soluciones.
      1. Haga 50 ml de solución de Krebs (KRH) a 125 mM de NaCl, 5 mM de cloruro de potasio (KCl), 1.2 mM de sulfato de magnesio (MgSO₄), 1.2 mM de fosfato de dihidrógeno de potasio (KH₂PO₄), 25 mM de ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) (tamponado a pH 7.4), 2 mM de cloruro de calcio (CaCl₂) y 6 mM de glucosa.
      2. Prepare 10 ml de solución de KCl-KRH (pH 7,4) a 80 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO₄, 1,2 mM de KH₂PO₄, 25 mM de HEPES (tamponado a pH 7,4), 2 mM de CaCl₂ y 6 mM de glucosa.
   3. Retire la cubierta de vidrio con células transfectadas e insértela en la cámara de imagen adecuada. Monta la cámara y añade 500 μl de solución de KRH en el centro del vaso.
   4. Agrega aceite sobre el objetivo. Coloque la cámara de imágenes en la platina del microscopio y coloque el objetivo debajo del cubreobjetos de vidrio. Coloque la cubierta de seguridad sobre la muestra.
   5. En el modo de epifluorescencia, concéntrese en el cubreobjetos (superficie superior) y elija las células transfectadas colocadas en el centro de la cámara. Seleccione celdas cuya señal fluorescente se pueda registrar claramente utilizando un tiempo de exposición inferior a 80 mseg.
   6. Bajo el control del software, cambie a la iluminación TIRF en modo en vivo.
   7. Para establecer la configuración TIRF, verifique la posición del haz que emerge del objetivo en la cubierta de la muestra (Figura 2B). Cuando el haz se coloca en el centro de la lente del objetivo (Figura 2A, izquierda), se ve un punto en el centro de la cubierta de muestra TIRF (Figura 2B, izquierda) y la célula se visualiza en modo de epifluorescencia (varios planos de enfoque, alta fluorescencia de fondo; Figura 2C, izquierda).
   8. Para alcanzar el ángulo crítico, mueva el punto enfocado en la dirección Y (hacia adelante o hacia atrás; Figura 2B, centro) usando el tornillo de ajuste de ángulo en el control deslizante TIRF (Figura 1C). Cuando el haz converge en el plano de la muestra en un ángulo mayor que el ángulo crítico (Figura 2A, derecha), la mancha desaparece y se hace evidente una línea recta, delgada y enfocada en el centro de la cubierta de la muestra (Figura 2B, derecha).
   9. Para ajustar el ángulo TIRF, utilice la muestra de celda (Figura 2C). Vea la imagen de fluorescencia en el video. En esta etapa, todavía es visible una imagen similar a la epifluorescencia. Mueva suavemente el tornillo hasta que se logre la condición TIRF: solo un plano óptico de la célula está enfocado (es decir, la membrana plasmática en contacto con el cubreobjetos). Esto da como resultado una imagen plana con alto contraste (Figura 2C, derecha).
3. Ejemplo de imagen
   1. Establece el experimento de lapso de tiempo de un solo canal. Para minimizar el fotoblanqueo, capture la imagen utilizando un tiempo de exposición bajo y una ganancia alta. Los tiempos de exposición adecuados son entre 40 y 80 mseg. Adquiera imágenes a una frecuencia de muestreo de 1 a 2 Hz. La cinética de las vesículas puede apreciarse mejor muestreando a mayor frecuencia (10 Hz). El tiempo regular de observación suele ser de 2 min.

Results

Figura 1. Configuración del microscopio TIRF. Vista esquemática e imagen (recuadro) del sistema de microscopio TIRF. La configuración comprende el microscopio invertido motorizado Axio Observer Z1 (A), un láser de iones de argón (B) multilí...

Materials