Microinyección estereotáctica de un vector viral para la manipulación génica en un cachorro de ratón estriado

Resumen

Fuente: Chen, S., et al., Cirugía estereotáxica para la manipulación genética en células estriatales de cerebros de ratones neonatales. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la inyección estereotáxica de un vector viral que codifica la recombinasa Cre y la proteína de fluorescencia verde o GFP en el cuerpo estriado de un cachorro de ratón modificado genéticamente para lograr la manipulación génica mediante la extirpación de un casete STOP flanqueado por loxP, activando la proteína de fluorescencia roja o RFP como informador.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Microinyección

1. Prepare la cirugía estéril limpiando bien el instrumento estereotáxico con etanol al 70%. Sumerja el instrumento quirúrgico en etanol al 70% para esterilizarlo.
2. Frote la cabeza del cachorro con etanol al 70%. Ubique la lambda de referencia en el cráneo y márquela con un rotulador. Apunte la punta de la aguja a la lambda y establezca las coordenadas antero-posterior (AP) y medial-lateral (ML) en cero.
3. Mueva el brazo de inyección al sitio objetivo de acuerdo con las coordenadas X e Y del sitio objetivo. Para el cuerpo estriado de las crías del día postnatal (P) 2, las coordenadas son: AP, +2,4 mm anterior a la lambda; ML, ±1,0 mm lateral desde la línea media; dorsal-ventral (DV), a -1,7 mm del cráneo. Marque la posición del tinte verde rápido en el tubo PE10 con un bolígrafo.
4. Baje la aguja de inyección 30G lentamente para penetrar a través de la piel y el cráneo, y luego suba la punta de la aguja hasta que se detenga en la superficie del cráneo. Establezca la coordenada DV en cero.
5. Baje lentamente la aguja de inyección 30G hasta que alcance la coordenada DV del sitio objetivo. Espere 1 minuto para permitir que el parénquima recupere su forma normal. Luego, ejecute el programa de microinyección (100 nL / min).
6. Asegúrese de que la marca del tinte verde rápido se mueva en el tubo de PE para asegurarse de que el líquido del virus se inyecte en el cerebro.
7. Espere 1 minuto después de la finalización de la microinyección y luego, lenta y progresivamente, suba la aguja a 1/2 de la altura de la profundidad DV dentro de los 30 s. Después de 30 s, retire lentamente la aguja de la cabeza del cachorro.

2. Recuperación postquirúrgica del cachorro

1. Calienta al cachorro durante 20 min en una incubadora a 33 °C. Verifique la recuperación del cachorro de la anestesia por hipotermia cada 5 minutos hasta que el cachorro haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
2. Devuelva al cachorro a la presa después de que el cachorro se haya recuperado por completo.

Materiales