Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para la visualización de eventos exocíticos

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Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuente: Winkle, C. C., et al. Utilización de metodologías combinadas para definir el papel de la administración de membrana plasmática durante la ramificación de axones y la morfogénesis neuronal. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar eventos exocíticos en neuronas corticales. Un marcador de proteína fluorescente verde (GFP) sensible al pH emite fluorescencia tras la fusión de vesículas, con excitación selectiva de TIRF que captura la exocitosis proximal de la membrana en imágenes de lapso de tiempo.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Obtención de imágenes de eventos exocíticos a través de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Nota: Este protocolo requiere un equipo de microscopía especializado, que incluye una cámara ambiental para mantener la temperatura, la humedad y el dióxido de carbono (CO₂), un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) invertido equipado con una iluminación epifluorescente, un objetivo TIRF de gran aumento / alta apertura numérica (NA), un XYZ automatizado y un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) sensible. Este protocolo utiliza un microscopio invertido totalmente automatizado equipado....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm placas de imagen de células vivas con fondo de vidrio	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	Debe recubrirse con 1 mg/ml de poli-D-lisina y enjuagarse antes de recubrir las células
Microscopio invertido Olympus IX81-ZDC2	Olympus
Lámpara de xenón Lambda LS	Sutter Instruments Company
Incubadora ambiental Tokai	Hit
100x 1.49 NA Objetivo TIRF	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell Software de control TIRF	Olympus		Software utilizado para controlar láseres para imágenes TIRF
Fiji (Imagen J)	NIH	ImageJ versión 1.49t
Policlonal de conejo anti-humano VAMP2	Señalización celular	11829
Poli-D-lisina	Sigma	p-7886	Disuelta en agua estéril a 1 mg / ml

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