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1. Obtención de imágenes de eventos exocíticos a través de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)
Nota: Este protocolo requiere un equipo de microscopía especializado, que incluye una cámara ambiental para mantener la temperatura, la humedad y el dióxido de carbono (CO2), un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) invertido equipado con una iluminación epifluorescente, un objetivo TIRF de gran aumento / alta apertura numérica (NA), un XYZ automatizado y un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) sensible. Este protocolo utiliza un microscopio invertido totalmente automatizado equipado con un objetivo TIRF de 100x 1,49 NA, un láser de estado sólido de 491 nm y un CCD multiplicador de electrones (EM-CCD). Todo el equipo está controlado por software de control láser y de imágenes. Antes del comienzo del protocolo de imágenes, encienda la cámara ambiental, el escenario, la lámpara, la computadora y la cámara.
- Seleccione el objetivo dentro del software de imágenes. Una vez que el objetivo esté en su lugar, sujete el calentador del objetivo alrededor del collar.
- Confirme que el objetivo esté completamente bajado antes de asegurar la incubadora de escenario en la ranura del escenario. Vierta agua destilada uniformemente en las entradas de la incubadora de etapa para evitar derrames.
- Encienda el sistema de incubación. Abra la válvula del tanque de CO2 y confirme que la presión es adecuada para el sistema según las instrucciones del fabricante. Deje que la cámara alcance un tiempo del 5% de CO2 y 37 °C. Antes de agregar el plato de imágenes, coloque un plato vacío en la incubadora para evitar la condensación de agua en el objetivo.
- Encienda la fuente láser.
- Abra la incubadora de escenario y agregue aceite de inmersión a la lente. Coloque la muestra en la incubadora y estabilícela con brazos de estabilidad o un peso de placa. Eleve el objetivo hasta que el aceite haga contacto con el fondo de la muestra. Cambie a iluminación de luz transmitida y encuentre el plano focal neuronal a través de los oculares.
- Inicie el software láser y conéctelo al software de control láser. Ajuste la iluminación a campo amplio y seleccione el objetivo (se recomienda 100x 1.49 NA TIRF). Establezca el índice de refracción de la muestra (celdas ~ 1.38). Ajuste la intensidad del láser desmarcando "TTL" (Transistor-Transistor Logic) para el láser de 491 nm. Ajuste el control deslizante a 100, luego vuelva a bajarlo a un valor entre 20% y 40%. Vuelva a verificar "TTL".
- Vuelva a concentrarse en la muestra con luz transmitida. Vaya al software de imágenes, seleccione la iluminación láser de 491 nm y abra el obturador. Ajuste con precisión el punto focal del láser en el techo y céntrelo en el centro del diafragma de campo cerrado con el condensador retirado. Coloque el condensador boca abajo en el banco óptico para no rayar la lente.
- Reemplace el condensador, vaya al software TIRF y establezca la profundidad de penetración (DP) en 110 nm. Luego, cambie de iluminación de campo amplio al modo de iluminación TIRF para obtener imágenes.
- Encuentre células que expresan la proteína de membrana 2 asociada a vesículas (VAMP2)-fluorina a través de los oculares utilizando epifluorescencia de campo amplio con la fuente de luz epifluorescente.
- Ajuste los parámetros de imagen (tiempo de exposición, ganancia y potencia del láser) para maximizar la relación señal-ruido y el rango dinámico utilizando el tiempo de exposición mínimo y la intensidad del láser para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad (por ejemplo, exposición entre 50 y 100 ms, con una ganancia de 15 a 30 al 30% de la potencia máxima del láser).
- Establezca el enfoque automático continuo por celda. Adquiera un conjunto de imágenes de lapso de tiempo con la adquisición cada 0,5 segundos durante 5 minutos. Para la condición estimulada con netrina-1, agregue 500 ng / ml de netrina-1 a la placa de células en una campana de flujo laminar y regrese la placa a la incubadora durante 1 hora antes de la obtención de imágenes.