Inhibición de la actividad neuronal y su detección mediante electrofisiología en una rata

Resumen

Fuente: Lai, J., et al. Registro electrofisiológico simultáneo y microinyecciones de agentes inhibidores en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra una técnica basada en microinyección para el registro e inhibición neuronal simultáneos en el colículo superior de rata. El procedimiento implica la focalización estereotáxica, la perforación del cráneo y la inserción de un inyectrode, que administra un neurotransmisor inhibidor mientras registra la actividad neuronal. La estimulación lumínica evoca potenciales de acción, mientras que la microinyección de fármacos suprime la excitabilidad neuronal. A medida que disminuyen los niveles de neurotransmisores, la actividad neuronal vuelve a la línea de base, lo que permite el estudio tanto de la inhibición como de la recuperación.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Montaje de la pipeta de registro-inyección

1. Tire de un capilar de vidrio de aproximadamente 7 cm de largo (1 mm de diámetro exterior) con un extractor de pipetas.
2. Rompe la punta del capilar y comprueba la abertura con un microscopio óptico. Confirme que el diámetro interior esté entre 30 μm y 40 μm.
3. Inserte un alambre plateado de 7 cm de largo en el capilar de vidrio con aproximadamente 1 cm que sobresalga del extremo no cónico de la pipeta de vidrio.
4. Doblar el exceso de filamento ortogonalmente al capilar de vidrio.
5. Aplique una gota de adhesivo plástico flexible en el eje de una aguja hipodérmica de 30 G.
6. Inserte una aguja hipodérmica de 30 G en la pipeta de vidrio de acuerdo con los esquemas presentados en la Figura 1.
7. Agregue una segunda capa de pegamento para asegurar un sellado adecuado de la unión entre la pipeta de vidrio y la aguja hipodérmica.
8. Deje que la pipeta se seque con la punta hacia arriba durante aproximadamente 12 horas para garantizar un curado adecuado del pegamento. El resultado final se muestra en la Figura 2.

NOTA: Este procedimiento se realiza en experimentos agudos y no es necesaria la esterilización de la punta de la pipeta.

2. Preparación del animal

1. Coloque la rata en una caja de anestesia.
2. Induzca la anestesia con isoflurano al 4% durante 5 a 10 min.
3. Coloque al animal sobre una mesa estereotáxica con una almohadilla térmica y una sonda rectal para mantener una temperatura corporal de 37 °C. Use un cono nasal para mantener la anestesia con isoflurano al 2%. Asegure la cabeza de la rata con barras para los oídos y un soporte para dientes.
4. Aplique ungüento oftálmico o gotas para los ojos, que incluyen gotas de atropina al 1% para ayudar en la dilatación de la pupila. Para evitar la sequedad, aplique gotas lubricantes aproximadamente cada 30 min.
5. Afeita la cabeza y límpiala con povidona yodada al 10%.
6. Para anestesia local, inyecte 0,5 ml de lidocaína al 2% debajo del cuero cabelludo en 2-3 lugares levantando la piel e insertando la punta de la aguja.
7. Confirme un nivel adecuado de anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie y observando la falta de movimiento. Además, monitoriza la frecuencia cardíaca para asegurarte de que está dentro de los valores normales (300 a 400 latidos/min).
8. Haga una incisión en el cuero cabelludo en línea recta a lo largo de la mediana con una hoja de bisturí # 10 para exponer las suturas coronal y sagital.
9. Revele los puntos Lambda y Bregma apartando el tejido que cubre el cráneo con una espátula quirúrgica.
10. Nivele el cráneo para que las posiciones Bregma y Lambda estén en el mismo plano.
11. Para establecer el punto de referencia, use un dispositivo estereotáxico con un tubo de vidrio montado para colocarlo justo encima de Bregma. Este será el "cero" para las coordenadas de medidas antero-posterior y medial-lateral.
12. Establezca el punto de interés moviendo la montura estereotáxica a las coordenadas requeridas, anote las coordenadas estereotáxicas y dibuje un cuadrado alrededor del área objetivo que marque dónde se realizará la craneotomía.
13. Use un taladro quirúrgico con una broca esterilizada a lo largo del cuadrado marcado lentamente sin presión para eliminar lentamente el material óseo. Tenga cuidado de no perforar demasiado tiempo en la misma área, ya que producirá calor y causará lesiones en la corteza.
14. Cuando el hueso que delimita la craneotomía se vuelve lo suficientemente delgado, retire con cuidado la sección craneal con pinzas para exponer la corteza.
15. Irrigar con frecuencia la corteza expuesta con líquido cefalorraquídeo artificial para evitar la desecación del tejido.
    NOTA: La eliminación de la duramadre es innecesaria en la rata ya que la punta del inyector es lo suficientemente resistente como para penetrar.

3. Llenado y montaje del sistema de inyección

1. Llene la microjeringa de 5-10 μl por aspiración con aceite mineral.
2. Llene la aguja hipodérmica con la pipeta de vidrio fija con una solución de Chicago Sky Blue (CSB) al 0,5% y ácido γ-aminobutírico (GABA) al 300 μM o una solución de lidocaína al 2% con CSB al 0,5%. Diluir todas las soluciones con solución salina.
   1. En el caso de una sustancia abundante, llene con una jeringa normal y utilice las técnicas de precaución habituales para evitar la formación de burbujas de aire.
   2. En el caso de sustancias más caras, use aceite mineral para llenar el inyector y el agente químico se puede introducir por aspiración. Como la diferencia de densidad entre el aceite mineral y el agua es relativamente alta, esta sustancia es una buena candidata para la inyección de soluciones acuosas.
      NOTA: Se puede agregar un colorante para confirmar la separación entre dos líquidos.
3. Para llenar la pipeta de inyección, llene una jeringa de 1 ml con la solución por aspiración y luego inyecte lentamente la solución en la pipeta de inyección.
4. Preste especial atención a las fugas en las regiones indicadas en la Figura 1 limpiando estas áreas y observando las fugas inyectando lentamente la solución con la jeringa.
5. Retire la jeringa de 1 ml. Al hacerlo, asegúrese de mantener una ligera presión sobre el émbolo para que el vacío no elimine la solución de la pipeta de inyección.
6. Llene la microjeringa con aceite mineral por aspiración y fíjela firmemente a la pipeta de inyección llena, luego limpie con cuidado cualquier exceso de solución del inyector ensamblado con una gasa.
7. Verifique que la punta no esté bloqueada inyectando un volumen muy pequeño, suficiente para ver una pequeña gota que se forma en la punta de la pipeta de vidrio.
8. Monte el inyector en el sistema de microbomba y asegúrese de que esté bien fijado.
9. Coloque con cuidado la punta inyectrode en las coordenadas objetivo y baje la punta a la superficie de la corteza.
10. Baje lentamente el inyectrode usando el aparato estereotáxico hasta la estructura objetivo (colículo superior en este caso) utilizando las coordenadas anatómicas apropiadas.
11. Cubra la corteza expuesta con agar tibio para evitar la desecación del tejido.

4. Inyección e inactivación reversible

1. Configure la bomba de microinyección para inyectar de 400 a 800 nl a 40 nl / min y presione Run para iniciar la inyección. Tenga en cuenta que la tasa de picos mostrará una reducción durante la inyección.
   NOTA: En la configuración experimental, la actividad neuronal se recuperó dentro de una hora después del final de la administración de GABA. Se puede utilizar cualquier dispositivo mecánico calibrado para aplicar presión sobre la jeringa de microinyección para realizar la inyección.
2. Después de la adquisición de los datos electrofisiológicos, eutanasia utilizando un método aprobado por el Comité de Ética Animal local.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del conjunto de inyectores. Se adjunta una microjeringa (A) a la pipeta de registro-inyección, que consiste en una aguja hipodérmica de 30 G (B) adherida a un alambre de pl...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bomba de inyección (UltraMicroPump III)	WPI
Consola de inyección (controlador Micro4)	WPI	#SYS-MICRO4
Jeringa Hamilton	Hamliton	(80301) 701LT 10 μL SYR	Jeringas entre 5 y 10 μL usadas
Adhesivo de cianoacrilato en gel	Krazy Glue	KG86648R	La forma de gel es más fácil de aplicar en el eje de la aguja hipodérmica de 30G
Pipetas de vidrio	WPI	#TW100F-4	Pared delgada, 1 mm de diámetro exterior, 0,75 mm de diámetro interior con pipetas de filamento utilizadas
720 Extractor de pipetas de aguja	Kopf	720
Alambre de plata	A-M Systems, Inc.	782500	Desnudo 0.010"

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