Entrega de genes subpiales en la médula espinal del ratón para evaluar la expresión génica

Resumen

Fuente: Tadokoro, T., et al. Administración del vector del virus adenoasociado subpial 9 (AAV9) en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra una técnica de inyección subpial para la administración de genes a la médula espinal en ratones. El procedimiento consiste en exponer la duramadre, perforar la piamadre e inyectar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que lleva un gen que expresa proteínas fluorescentes en el espacio subpial. Después de la inyección y la recuperación, el virus facilita la expresión génica en las células de la médula espinal, lo que permite el estudio de la expresión génica diana.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparación general animal y quirúrgica

1. Antes de iniciar el procedimiento quirúrgico, descongele el virus (AAV9-UBI-GFP [UBI: Promotor de ubiquitina, GFP: Proteína verde fluorescente]; 5 μL de alícuotas). Prepare una solución de dextrano al 5% (10.000 MW) mezclando polvo de dextrano en agua destilada. Mezclar la solución del virus con una solución de dextrano al 5% 1:1 hasta obtener una concentración final de dextrano del 2,5%.
   1. Almacenar la solución del virus en hielo (4 °C).
2. Utilice ratones adultos C57BL/6J (machos y hembras, 20-30 g). Anestesiar a los ratones con isoflurano al 5% (en O₂, 1 L / min) y mantenerlos al 2-3% de isoflurano inhalado (en O₂, 1 L / min) mediante el cono de la nariz durante la cirugía, dependiendo de la frecuencia respiratoria y la respuesta del pellizco de la pata.
3. Afeitar el lomo de los animales con un cortaúñas de afeitar y limpiar la piel con clorhexidina al 2%.
4. En estudios de recuperación crónica, siga una técnica estéril estricta.
5. Si se van a realizar inyecciones subpiales lumbares, corte la piel que recubre las vértebras Th8-L1 con un bisturí y separe el músculo paravertebral de las vértebras espinales Th10-12 con unas tijeras.
   1. Monte al animal en un marco estereotáxico estándar usando pinzas espinales de ratón.
   2. Afeitar ambos lados de la lámina de las vértebras Th10-12 con un taladro dental (broca: 0,9 mm, velocidad: 20.000 rpm) hasta que aparezcan grietas.
   3. Retire los fragmentos de hueso agrietados con fórceps y exponga la superficie dorsal de la médula espinal lumbar.
   4. Corta la duramadre aproximadamente 1 cm con una aguja y unas pinzas de acero inoxidable de 30 G.

2. Apertura de la membrana pial e inserción de la aguja subpial para la administración de AAV9

1. Monte la aguja penetrante de pia de 34 G en el brazo Z de un manipulador XYZ utilizando un soporte capilar de vidrio (Figura 1A y B).
   NOTA: Para fabricar la aguja penetrante de pia, la punta biselada original de la aguja de 34G se afila con una biseladora capilar de vidrio con placa abrasiva de diamante - gruesa (punta de 5,0 μm a 50 μm tamaños) y un ángulo de rectificado de 15 a 20°. La punta de la aguja (1 mm de longitud, medida desde la punta) se dobla suavemente a unos 90° (Figura 1B, inserto izquierdo).
2. Con un endoscopio de disección quirúrgica, ajustado a un aumento de 8-10X, penetre la pia con la aguja de penetración de pia aproximadamente 1 mm (Figura 1C) usando el brazo en X.
   1. Mantenga el ángulo de la aguja penetrante con respecto a la superficie del tejido a 5-10°.
3. Después de la abertura de pia, retire la aguja de penetración de pia horizontalmente del espacio subpial (Figura 1D) usando el brazo en X.
   NOTA: Recuerde el sitio penetrado por un punto de referencia, como un vaso sanguíneo.
4. Cargue una aguja de inyección 36G roma con el virus AAV9-UBI-GFP utilizando una microjeringa de 50 μL conectada a la aguja de inyección con un tubo PE-10 o PE-20.
5. Monte la aguja en el brazo en Z de un segundo manipulador XYZ (Figura 1A y B) utilizando un soporte capilar de vidrio (Figura 1B, inserto derecho).
   NOTA: Para fabricar la aguja de inyección AAV9 subpial, la punta roma de una aguja de 36 G se pule con un biselado capilar de vidrio con placa abrasiva de diamante, gruesa (tamaños de punta de 5,0 μm a 50 μm) para eliminar los bordes afilados. La punta de la aguja (2-3 mm de longitud, medida desde la punta) se dobla suavemente a unos 90°. Las agujas de inyección subpial y penetrantes de pia se insertan en un tubo de acero inoxidable esclavo 20G de 1-2 cm de largo (10 mm desde el extremo de la aguja) y se pegan con epoxi. Se requiere el uso de tubos de 20 G (0,91 mm de diámetro) para una fijación segura al soporte capilar de vidrio.
6. Manipulando los brazos X, Y y Z del segundo manipulador, coloque la punta de la aguja de inyección AAV9 en el sitio penetrado en pia y luego hágala avanzar unos 2-3 mm en el espacio subpial a través de la abertura de la membrana pial anterior utilizando el brazo X (Figura 1E y F).
   NOTA: 1) El AAV9-UBI-GFP se prepara de acuerdo con los protocolos informados anteriormente, y los títulos finales se ajustan a 1,2 x 10¹³ copias del genoma por ml (gc / ml). 2) No es necesario marcar el sitio de la abertura pial porque es fácilmente identificable (Figura 1D).
7. Inyecte el AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 o 5 μL) en el espacio subpial con una microjeringa de 50 μL (consulte la Tabla 1 para los grupos experimentales).
8. Retire la aguja de inyección del espacio subpial después de que se complete la inyección AAV9-UBI-GFP.
9. Cierre el músculo y la piel con sutura de monofilamento 4.0 y clips quirúrgicos.
   NOTA: No es necesario sellar la vértebra abierta.
10. Permita que los animales se recuperen en una almohadilla térmica.
11. Para controlar el dolor, inyecte buprenorfina 0,05 mg / kg / sc cada 12 h durante 2-3 días después de la cirugía.

Tabla 1: Grupos experimentales. Todos los experimentos se realizaron en ratones adultos C57BL / 6J.

Grupos experimentales	Sitio/nivel de administración de AAV9 (*)	Volumen de AAV9 inj, velocidad de infusión	Tiempo de supervivencia	Análisis tisular
Grupo A (n = 7)	C2 (bilateral)	5 μL/5 min	14 días	Cerebro + médula espinal
Grupo B (n = 12)	L1-L2 (bilateral)	1,5 μL o 3μL, 60 seg/μL	14 días	Cerebro + médula espinal
Grupo C (n = 6)	C2 + L1-L2 (bilateral en cada nivel)	5 μL/5 min	14 días	Médula
* - bilateral = se realizan dos inyecciones subpiales, una administrada en el espacio subpial derecho y otra en el espacio subpial izquierdo del segmento o segmentos inyectados.

espinal

Resultados

Figura 1: Configuración experimental para realizar inyecciones subpiales espinales en un ratón adulto. (A) Para realizar inyecciones subpiales espinales en ratones adultos, se utilizan dos manipuladores XYZ s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Adaptador espinal para ratones	Harvard Apparatus	72-4811
Manipulador XYZ	Stoelting	51604
Bomba de infusión manual	Stoelting	51218
Aguja de nanofill biselada de 34G	World Precision Instruments	NF34BV-2
Aguja de nanofill roma de 36G World	Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurano	MWI Veterinary Supply 502017
Solución de clorhexidina	MWI Veterinary Supply	501027
Aguja de acero inoxidable 20G	Becton-Dickinson	305175
Aguja de acero inoxidable 23G	Becton-Dickinson	305145
Aguja de acero inoxidable 30G	Becton-Dickinson	Aplicador
	MWI Veterinary Supply	27426
Biseladora capilar de vidrio	Narishige International	SM-25B
Microscopio de portaobjetos Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microjeringa	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubo	Becton, Dickinson	427401
4-0 sutura monofilamento	VetOne	V1D397
Biseladora capilar de vidrio	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxi (Epoxi transparente)	Devcon	14310
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Laboratorio central de vectores virales

con punta de algodón 305128 Becton-Dickinson