Implantación de ventana de la médula espinal en un ratón para imágenes in vivo

Resumen

Fuente: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomía e implantación de ventana de la médula espinal en el ratón. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la implantación de una ventana de la médula espinal en un ratón anestesiado para imágenes in vivo. El protocolo estabiliza la médula espinal expuesta utilizando una cubierta de vidrio de borosilicato y una placa posterior impresa en 3D. Este método permite la microscopía de dos fotones de alta resolución para estudiar la dinámica de la barrera hematoencefálica y las interacciones neurovasculares.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Implantación de cubreobjetos

1. Aplique suavemente un cubreobjetos de borosilicato de 3 mm al cordón expuesto.
2. Asegúrese de que la agarosa se enfríe a 39 °C. Con una espátula pequeña, aplique agarosa tibia al 2%/aCSF (líquido cefalorraquídeo artificial) en el borde del cubreobjetos y deje que la acción capilar la atraiga debajo de la superficie.
   Nota: A temperaturas inferiores a 39 °C, la agarosa puede comenzar a gelificarse. Si esto ocurre, vuelva a calentar usando un baño de agua o microondas. Algunos operadores prefieren aplicar primero una gota de agarosa y colocar el cubreobjetos encima.
3. Aplique adhesivo tisular a los procesos articulares óseos expuestos de las vértebras adyacentes intactas a nivel torácico 11 de la columna vertebral y columna vertebral del nivel torácico 13. Aplique adhesivo tisular adicional en un anillo alrededor del sitio de laminectomía, sobre el tendón adyacente y el proceso transversal.
   Nota: Se requiere adhesivo tisular para una adherencia adecuada al cemento dental en los pasos posteriores. Los procesos articulares forman un asiento natural sobre el que la placa posterior puede descansar de manera estable (Figura 1). La adhesión a los procesos articulares formará los puntos de unión más fuertes.
4. Mezcle el cemento dental con el acelerante en una bandeja mezcladora de porcelana. Utilice una espátula pequeña para transferir el cemento dental a la capa adhesiva del tejido. Use cemento dental para adherir la placa posterior al campo quirúrgico centrado sobre la ventana. Espere 10 minutos para que el cemento dental se cure.
   Nota: La firme adhesión de la placa posterior a los procesos articulares anterior y posterior proporciona la estabilidad estructural fundamental del implante.
5. Use cemento dental adicional para rellenar la base interior de la placa posterior y la parte inferior de la placa posterior: interfaz de tejido.
   Nota: La aplicación adicional de cemento dental mejora la adherencia y reduce el riesgo de fuga de líquido de inmersión del objetivo del microscopio (solución salina) por la parte inferior de la placa posterior.
6. Avance el soporte de la placa posterior bifurcada a la posición adecuada sobre la ventana. Asegure la placa posterior en el soporte de la placa posterior con tornillos.
   Nota: Este protocolo utilizó un soporte de placa posterior mecanizado a medida (Figura 2G\u2012H).
7. Aplique solución salina a la placa posterior para detectar fugas. Si hay alguna fuga de líquido, seque el área y aplique más cemento dental.

2. Preparación de imágenes

1. Transfiera el animal a la plataforma quirúrgica a la mesa óptica.
   Nota: Nuestra plataforma quirúrgica, soporte de placa posterior y soporte de cono nasal de isoflurano se pueden transportar entre estaciones de imágenes quirúrgicas y de dos fotones como una unidad mientras se aplica anestesia continua con isoflurano (Figura 2D, H). Se pueden ensamblar unidades similares a partir de horquillas de sujeción, vigas y postes de pilares de apoyo que se pueden obtener de fuentes comerciales (por ejemplo, ThorLabs). Para la microscopía intravital, debe haber al menos 11 pulgadas de espacio libre entre el objetivo del microscopio y la mesa óptica para acomodar la altura de la plataforma quirúrgica.
2. Fije la plataforma quirúrgica a la mesa óptica mediante un poste de montaje de acero inoxidable y una horquilla de sujeción avellanada.
3. Aplique solución salina fresca en el pocillo de la placa posterior. Baje una lente de inmersión en agua en el pozo.
4. Utilice luz transmitida o de epifluorescencia para identificar el área de interés y enfoque. Cambie al modo de escaneo láser y realice imágenes in vivo de acuerdo con los filtros apropiados de longitud de onda de excitación láser de dos fotones, dicroicos y de paso de banda para los fluoróforos presentes en el tejido6.

Resultados

Figura 1. Representación esquemática de la ubicación anatómica de la ventana de la médula espinal. A) Representación esquemática de la vista superior de un cuerpo vertebral torácico inferior, apófisis espinosa y segmento de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa posterior ovalada impresa en 3D	personalizada		Campo de imágenes estabilizadoras
Microscopio de disección quirúrgica	Leica	M205 C	Equipado con Leica FusionOptics, objetivo Planapo 0.63x de la serie M y platina deslizante
Cámara de microscopio	Leica	MC170	HD cámara a color para visualizar el campo quirúrgico
Etapa deslizante	Leica	10446301	La etapa deslizante está construida con dos placas de metal. La placa base es fija. La placa superior se desliza sobre una interfaz engrasada para permitir el movimiento rotacional y lineal.
Estación quirúrgica y horquilla de estabilización	Whale Manufactoring	custom	Laminectomía
Unidad de administración de isoflurano de bajo flujo SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01 Administración de	anestesia quirúrgica con vaporizador digital integrado
Poste de montaje de acero inoxidable de 1,5 pulgadas	ThorLabs	P50/M	Para montar la estación quirúrgica en la mesa óptica para la obtención de imágenes
de dos fotonesHorquilla de sujeción avellanada para montaje de 1.5" Post	ThorLabs	PF175	Para estabilizar la estación quirúrgica montar en la mesa óptica para imágenes de dos fotones
Microtaladro óseo ideal	Aparato Harvard	72-6065	Adelgazamiento óseo para laminectomía
Baño de agua	Fisher Scientific	15-462-10	Pistola
de cauterización	FST	18010-00	Cauterización de hemorragias menores
Almohadilla térmica	Benchmark	BF11222	Calentador de silicona de 1,9" x 4,5" con cables de teflón de 20", 10 W, sonda
rectal termoacoplada tipo K	5 V Physitemp	RET3	Medición de la temperatura corporal del ratón
Vaselina	Sigma	8009-03-08	Sonda rectal lubricante
Controlador térmico regulado por retroalimentación	NA personalizado		Las alternativas disponibles comercialmente incluyen la serie Physitemp TCAT
PVA Lanzas quirúrgicas para ojos	Beaver-visitec international	40400-8
Recortadora eléctrica	absorbente de sangre Wahl	41590-0438	Recortadora de piel de ratón
Cuchilla, #11	FST	14002-14	Pinzas para herramientas quirúrgicas
, #5	FST	11254-20	Pinzas para herramientas quirúrgicas
, #4	FST	14002-14	Herramienta quirúrgica
Pinzas dentadas de titanio	WPI	555047FT	Herramienta quirúrgica
Tijeras de iris de titanio	WPI	555562S	Herramienta quirúrgica
Adhesivo tisular Vetbond	3M	084-1469SB	Preparación de la superficie del tejido para acrílico dental
Bandeja de mezcla de cerámica	Jack Richeson	420716	Mezcla de agente acrílico dental con acelerante
Orthojet acrílico dental	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	Pegando permanentemente la placa posterior al tejido
Pequeña cubierta redonda de vidrio, espesor #1, 3 mm	Aparato Harvard	64-0720	ventana óptica
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	Para aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	Para aCSF
Glucosa	Fisher Scientific	50-99-7	Para aCSF
HEPES	Sigma	7365-45-9	Para aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	Para aCSF
CaCl₂·2H₂O	Fisher Scientific	#################	Para aCSF
Carprofeno	Rimadyl	QM01AE91	Analgesia
Agua bacteriostática	Henry Schein		2587428 Diluyente para carprofeno
Isoflurano	Henry Schein	11695-6776-2	Anestesia
Solución de ringer lactato	Baxter	0338-0117-04	Hidratación para ratón
Agarosa Punto de gel High EEO	Sigma	A9793	34-37 grados C
Ungüento lubricante oftálmico Lágrimas	de	Akwa68788-0697	Prevenir el secado de la córnea
MOM Microscopio de dos fotones	Sutter

salina caliente de 10 W,