Monitoreo de la expresión génica en tiempo real en cortes de cerebro a través de imágenes tridimensionales

Resumen

Fuente: Shimojo, H., et al. Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de Notch durante la neurogénesis murina. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, se utilizan cultivos de cortes corticales de embriones de ratón transgénicos para monitorear la expresión génica a través de imágenes tridimensionales. La bioluminiscencia, la fluorescencia y las imágenes de campo claro se utilizan para visualizar la expresión génica en tiempo real durante la diferenciación neuronal dentro del tejido nativo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal correspondiente.

1. Visualización de la expresión del reportero de luciferasa en cultivos de cortes
   1. Inicie el sistema de imágenes en vivo de luminiscencia antes de iniciar la disección. Utilice las siguientes condiciones para cultivos de cortes corticales: 40% O₂, 5% CO₂ y 37 °C.
   2. Ponga el aceite de inmersión en la lente del objetivo de 40x. Coloque el plato de muestra en la platina del microscopio. Adquiera la imagen de prueba fluorescente y establezca la posición y el plano de enfoque en la región de interés bajo la iluminación de la luz de excitación.
   3. Ejecute la adquisición de lapso de tiempo mediante adquisiciones tridimensionales (luminiscencia, fluorescencia y campo claro) durante 24 h (Figura 1F-H). Para la adquisición de imágenes de luminiscencia, utilice los siguientes ajustes de la cámara: baja velocidad de transferencia (50 kHz), binning de 2x2/4x4, tiempo de exposición de 10 min/5 min. Para la adquisición de imágenes de fluorescencia y campo claro, utilice los siguientes ajustes: velocidad de transferencia intermedia (1 MHz), binning 1x1 y tiempo de exposición de 100 ms.

Resultados

Figura 1: Realización de los cortes corticales del telencéfalo embrionario y visualización de la dinámica de la proteína Dll1 en los cultivos de cortes corticales. (A) Comprobación de la expresión de EGFP utilizando un microscopio estereoscóp...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Circulador de agua enfriada (enfriador)	Julabo	Modelo: F12-ED
Cámara CCD refrigerada	Andor Technology	Modelo: iKon-M 934
Sistema de incubación	TOKAI HIT	Modelo: INU-ONICS
Microscopio invertido	Olympus	Modelo: IX81
Microscopio invertido	Olympus	Modelo: IX83
Dispositivo de iluminación LED	CoolLED	Modelo: pE1
MetaMorph	MOLECULAR DEVICES	Modelo: 40000
Controlador de mezcla de gas	Tokken	Modelo: TK-MIGM OLO2
Lente de objetivo	Olympus	Modelo: UPLFLN 40X O