Administración intravenosa de bloqueadores de receptores para reducir el edema cerebral en un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Zeynalov, E. et. al., La infusión intravenosa continua es la ruta de tratamiento de elección para el bloqueador del receptor de arginina-vasopresina conivaptán en ratones para estudiar el edema cerebral evocado por un accidente cerebrovascular. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la administración intravenosa de un antagonista del receptor de arginina-vasopresina (AVP) en un modelo de ratón. La oclusión transitoria de la arteria cerebral media induce edema cerebral. Se administra un antagonista del receptor AVP a través de un catéter en la vena yugular izquierda, aliviando el edema.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Inducción de accidente cerebrovascular in vivo

1. Recubrimiento previo del filamento con resina dental antes de la cirugía.
   1. Corta un trozo de filamento de 12 mm de largo de una sutura de nailon 7-0. Mezcle 2 partes de la resina con 1 parte del endurecedor y luego sumerja inmediatamente la punta del filamento en la mezcla para cubrir aproximadamente 1/3 de toda la longitud. Retírelo rápidamente y verifique que esté cubierto con una capa de resina dental de superficie lisa.
   2. Seque el filamento al aire durante 2 horas antes de usarlo.
2. Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia (volumen de 2 L) y ajuste el flujo de isoflurano al 1,5% en aire ambiente enriquecido con oxígeno al 25% a 2 L/min entrando en la cámara.
3. Deje que el ratón permanezca en la cámara de inducción hasta que esté completamente anestesiado, según lo determinado por la falta de respuesta al pellizco de la cola.
4. Coloque el mouse sobre la mesa de operaciones con una almohadilla térmica y ajuste la concentración de isoflurano al 1% para mantener la anestesia administrada espontáneamente a través del cono de la nariz.
5. Corta el cabello en la parte delantera y trasera del cuello y rocía el cuello con alcohol isopropílico. Aplique ungüento oftálmico veterinario en ambos ojos.
6. Para controlar continuamente la temperatura corporal, utilice una sonda de temperatura rectal conectada a una pantalla digital durante la cirugía.
7. Coloque el ratón en posición supina, aplique una solución exfoliante de povidona yodada al 10% para desinfectar, cúbralo con un paño estéril y luego haga una incisión en la línea media a lo largo del cuello con una hoja de bisturí quirúrgico de tamaño 10.
8. Lime temporalmente la arteria carótida común izquierda (CCA) con una sutura de seda 6.0.
9. Coloque otra atadura en la arteria carótida externa izquierda (ECA).
10. Coloque un clip microvascular en la arteria carótida interna (ICA).
11. Corta un pequeño agujero en la arteria carótida externa con unas tijeras microvasculares. Inserte un filamento hecho de sutura de nailon 7-0 recubierta con resina dental en la abertura del ECA y avance cefálicamente, mientras retira el clip, hasta que sienta resistencia (aproximadamente 5-7 mm desde el punto de bifurcación del CCA).
12. Coloque una atadura temporal en la arteria carótida interna para asegurar el filamento en su posición. Consulte el diagrama, Figura 1A. Cierre la piel con una sutura de seda e infiltre la herida en la parte delantera del cuello con 0,2 ml de bupivacaína al 0,5%, como en el paso 2.6.
13. Deje que el ratón se despierte de la anestesia y recupere la conciencia en una cámara de recuperación durante 60 min. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
14. Pruebe el ratón para determinar la puntuación de déficit neurológico (NDS) de la siguiente manera: 0 = función motora normal, 1 = flexión del torso y de la extremidad anterior contralateral en la elevación de la cola, 2 = dar vueltas hacia el lado contralateral pero postura normal en reposo, 3 = inclinarse hacia el lado contralateral en reposo, 4 = sin actividad motora espontánea.
    1. Para la prueba NDS, levante el mouse por la cola y colóquelo sobre una superficie plana para observarlo (2-3 min). Alternativamente, observe ratones en la cámara de recuperación. Excluir del experimento a los ratones que exhiben NDS inferior a 2 debido a una oclusión insuficiente de la arteria carótida media (MCA).
       NOTA: La técnica de flujometría láser Doppler se puede utilizar para confirmar la oclusión de MCA.
15. Vuelva a anestesiar al animal después de 60 minutos de recuperación en la cámara de inducción como se describió anteriormente, vuelva a esterilizar la incisión cutánea anterior con una solución exfoliante de povidona yodada al 10% y vuelva a abrir la herida quirúrgica en la parte delantera del cuello cortando y retirando la sutura de seda.
16. Para retirar el filamento del ECA, realice los siguientes pasos:
    1. Coloque un clip microvascular en el ICA. Desate la sutura del ICA y saque el filamento mientras mantiene el clip abierto.
    2. Cierre el clip y coloque una corbata en el ECA proximal al corte.
    3. Retire el clip y la ligadura del CCA para restaurar el flujo sanguíneo al cerebro. Consulte el diagrama, Figura 1B.

2. Instalación del catéter intravenoso (IV) en la vena yugular para un tratamiento continuo de 48 horas

NOTA: Proceda a la instalación del catéter inmediatamente después del paso 1.16.3 sin despertar al ratón.

1. Use dos tamaños diferentes de tubos flexibles: inserte el tubo interior (0,94 mm de diámetro exterior; para contener el fármaco que se está infundiendo) en el tubo exterior (3,18 mm de diámetro exterior; para proteger el tubo interior).
2. Coloque el ratón en posición prona, aplique una solución exfoliante de povidona yodada al 10% para desinfectar y haga una incisión de 1 cm en la parte posterior del cuello con una hoja de bisturí quirúrgico de tamaño 10. Gire el ratón a la posición supina, vuelva a esterilizar la parte delantera del cuello con una solución exfoliante de povidona yodada al 10% y vuelva a abrir la herida quirúrgica en la parte delantera del cuello. Haga un túnel en el tubo debajo de la piel desde la incisión realizada en la parte posterior hasta la parte delantera del cuello y exteriorícelo desde la herida abierta 1 cm.
3. Retire el tejido adiposo subcutáneo del lado izquierdo de la parte frontal del cuello aproximadamente 1 cm lateralmente desde la línea media. Localice la vena yugular izquierda, coloque dos ataduras a lo largo de la vena a 5 mm de distancia y estire ligeramente la vena. Haga un pequeño orificio en la vena yugular entre las dos ataduras con unas tijeras microvasculares; Inserte la punta del tubo interior a 5 mm de profundidad caudalmente (hacia el corazón).
4. Asegure el tubo con ambas ataduras a la vena yugular. Cierre la piel de la parte delantera del cuello con una sutura de seda 3-0. Consulte el diagrama, Figura 1C.
5. Asegure el tubo a la piel en la parte posterior del cuello con una sutura y conecte el tubo a una bomba intravenosa de microinfusión a través de un eslabón giratorio. El eslabón giratorio permite el libre movimiento de los ratones dentro de la jaula con acceso completo a la comida y el agua.
6. Infiltrar las incisiones cutáneas en la parte delantera y posterior del cuello con 0,2 ml de bupivacaína al 0,5% para prevenir el dolor postoperatorio.
   NOTA: Dependiendo de los protocolos específicos de la institución para animales, los animales pueden ser tratados con opioides, antiinflamatorios no esteroideos (AINE) o antibióticos antes y después de la operación. Sin embargo, los tratamientos mencionados pueden alterar los resultados del resultado del accidente cerebrovascular isquémico.
7. Permita que el animal se despierte en la cámara de recuperación y luego aloje al animal en una jaula separada hasta el punto final del experimento. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
8. Ajuste la velocidad de infusión para el tratamiento intravenoso continuo de 48 horas de conivaptán (0,14 mg/ml en dextrosa al 5%) o vehículo en 1,5 ml/kg/h, e inicie la infusión.
   NOTA: La cantidad total de conivaptán infundido por vía intravenosa debe ser de aproximadamente 0,2 mg/ratón/día en un volumen total de 1,44 ml.

Resultados

Figura 1: Diagrama del modelo experimental de accidente cerebrovascular, instalación de catéter intravenoso y volumen representativo de infarto a las 48 horas después del accidente cerebrovascular. Posición del filamento (mostrado en azul...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Almohadilla calentada	K&H Manufacturing Inc	1060
Monitor de temperatura con sonda rectal	Physitemp	7029
Carrete de sutura de seda, 6-0	Surgical Specialties Corporation	SP114
Sutura de seda en aguja, 3-0	Ethicon	1684G
Sutura de nylon, 7-0	Ethicon	1696G
Resina dental polisiloxano con endurecedor	Heraeus Kulzer	65817930
Bomba intravenosa de microinfusión	Kent Scietific	GT0897
Giratorio 22GA	Instech	375/22PS
Tubos de laboratorio, 0,94 x 0,51 mm	Dow Corning	508-002
Tubos de laboratorio, 3,18 x 1,98 mm	Dow Corning	508-009