Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.
1. Inyección de factores de reprogramación en la
- configuración del animal cerebral, colocación estereotáxica y perforaciónNOTA: Este protocolo se centra en el uso de Ascl1, Lmx1a y Nurr1 (ALN) para la reprogramación de la glía NG2 (antígeno neuronal-glial 2) en interneuronas. En nuestra experiencia, las interneuronas de un fenotipo similar se pueden obtener utilizando otras combinaciones de factores
- Mueva el brazo M/L-D/V del marco estereotáxico a su lugar (por encima del animal) y asegúrelo.
NOTA: El marco estereotáxico permite el ajuste de la jeringa a lo largo del eje anterior/posterior (eje A/P, Y), medial/lateral (eje M/L, X), y eje dorsal/ventral (eje D/V, Z). - Mueva la jeringa a lo largo de los diferentes ejes del marco estereotáxico para llevar la punta del capilar de vidrio justo por encima del bregma (el punto de unión donde se unen las diferentes placas del cráneo).
- Asegúrese de que la punta capilar esté perfectamente recta en los planos A / P y M / L. En caso de un bregma ambiguo, tome el promedio de las suturas lateral y media.
- Cuando la punta del capilar esté colocada correctamente por encima del bregma, restablezca los valores M/L y A/P a 0,0 en el contador de coordenadas digital.
- Para asegurarse de que la cabeza del animal esté en una posición perfectamente plana, use el contador de coordenadas digital para medir el valor de las coordenadas D/V cuando el brazo A/P está en +2.0 y -2.0 (M/L = 0.0), así como cuando el brazo M/L está en +2.0 y -2.0 (A/P = 0.0). Ajuste la altura de la barra dental y las barras de los oídos en consecuencia.
- Mueva la jeringa a las coordenadas deseadas para la inyección de vectores virales en el cuerpo estriado (A / P = +1.0; M/L = -2.0, en relación con el bregma).
- Levante ligeramente la jeringa y, mirando el lugar de la inyección a través del microscopio, taladre un orificio con un taladro dental en las coordenadas de inyección. Comience a perforar en el sitio, trabajando de manera circular y suave.
NOTA: No ejerza demasiada presión hacia abajo, ya que la broca debe estar lo suficientemente afilada como para atravesar el hueso sin fuerza adicional. Evite la perforación prolongada y sostenida, ya que esto crea calor. - Al final de la perforación, verifique que la duramadre permanezca intacta y expuesta para la inyección.
- Preparación de la jeringa
- Coloque un trozo de gasa de algodón sobre la incisión abierta y enjuague la jeringa con solución salina.
- Después del lavado, tome una burbuja de aire de 1 a 2 μL, seguida de 1 μL de solución que contenga los vectores virales, evitando burbujas involuntarias. Asegúrese de que la solución viral se pueda visualizar fácilmente debajo de la burbuja de aire, mientras se inyecta.
- Inyección viral
- Retire la gasa de algodón sobre el sitio de la incisión y baje la jeringa con el brazo D/V del marco estereotáxico. A medida que se acerca a la superficie del cráneo, mire cuidadosamente a través del microscopio y mida el nivel de D/V de la duramadre: debe sobresalir ligeramente bajo una presión suave.
- Mientras toca la duramadre con la punta del capilar, establezca la coordenada D/V en 0.0.
- Baje la jeringa, progresando lentamente hasta la profundidad deseada (D/V = -2,7, en relación con la duramadre). Asegúrese de que la trayectoria esté libre de fragmentos óseos, de modo que no se observe flexión de la aguja/capilar.
NOTA: Las coordenadas presentadas se refieren a una inyección de los factores de reprogramación en el cuerpo estriado de ratones NG2-Cre. Se pueden usar coordenadas correspondientes a otras regiones del cerebro. Siempre pruebe primero las coordenadas para la inyección con un tinte (por ejemplo, azul de tripano), inyección de perlas de colores o un vector viral indicador antes de inyectar factores de reprogramación en el cerebro de una nueva cepa de ratón. Si se inyecta azul de tripano, los animales deben sacrificarse inmediatamente después de la cirugía y el cerebro diseccionado. Los cerebros frescos se pueden cortar con un micrótomo, mientras se congelan, y el sitio de inyección se determina mediante la visualización de la posición del tinte en el cerebro. Si las coordenadas de prueba usan perlas de colores, es posible determinar el sitio de inyección en cerebros perfundidos y cortados una semana después de la inyección. Alternativamente, se puede usar una inyección con un vector viral que lleva un gen reportero y determinar el sitio de inyección en cerebros cortados perfundidos. - Inyecte 1 μL de la solución viral a una velocidad de 0,4 μL/min. Cuando se inyecte todo el volumen, deje un período de difusión de 2 minutos antes de retirar la jeringa.
- Después de la difusión, retraiga lentamente la jeringa hasta que la punta del capilar esté completamente fuera del cerebro.
- Coloque un trozo de gasa de algodón sobre la herida y enjuague la jeringa con solución salina.
- Mueva el brazo M/L-D/V del marco estereotáxico fuera del área de trabajo.
- Cierre de heridas y procedimientos postoperatorios
- Suturar cuidadosamente la incisión con hilo de sutura.
NOTA: Todos los hilos de sutura utilizados en animales inyectados deben desecharse en una taza/vial que contenga una solución detergente antiviral. La misma solución se utiliza para limpiar todas las superficies que rodean el área de la cirugía que han estado en contacto con materiales quirúrgicos. Todas las herramientas quirúrgicas se lavan a fondo y se esterilizan en autoclave al final de cada día de cirugía. - Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en una estación postoperatoria, que incluye una jaula limpia y con calefacción, acceso a comida y agua, y donde el animal permanece hasta que esté completamente despierto. Durante este período, vigile de cerca al animal hasta que recupere la conciencia.
- No aloje animales operados con animales no operados hasta que los primeros se hayan recuperado completamente de la cirugía.
- Supervise a los animales operados diariamente. Dependiendo de las suturas utilizadas, asegúrese de retirarlas si es necesario. A todos los animales se les administró Bupenorphinum (Temgesic a 1 ml/kg) por vía subcutánea como cuidado postoperatorio.
NOTA: Si se opera con la misma jeringa durante dos días consecutivos, enjuague con agua, seguido de etanol al 70% y agua nuevamente. Deje la jeringa llena de agua durante la noche para permitir la disolución de cualquier posible residuo.