Administración electroforética de GABA en el foco epiléptico de un ratón anestesiado

Resumen

Fuente: Slezia, A. et al. La administración electroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) en el foco epiléptico previene las convulsiones en ratones. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la administración electroforética de ácido gamma-aminobutírico (GABA) para inhibir la actividad convulsiva en un ratón anestesiado. Describe los pasos involucrados en la implantación de la sonda, el registro de la actividad neuronal, la inducción de convulsiones y la administración controlada de GABA a través de una bomba de iones microfluídicos para evaluar su eficacia terapéutica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Cirugía/Craneotomía

1. Fijar la cabeza de un ratón anestesiado en un marco estereotáxico. Con una aguja de 30 G, inyecte ropivacaína analgésica local (5 μL, 7,5 mg/mL, consulte la Tabla de materiales) por vía subcutánea en el sitio de incisión planificado. Espere 5 minutos para que haga efecto.
2. Haga un corte recto en la línea media de la piel por encima del cráneo con un bisturí. Tire suavemente de la piel hacia los lados con pinzas finas y sujétela a un lado con pinzas de serrefina de bulldog para dejar el cráneo expuesto para un trabajo adicional.
3. Limpie el cráneo de la fascia con un bisturí o cualquier herramienta similar. En caso de sangrado superficial, retire la sangre con hisopos de algodón o pequeños trozos de toalla de papel.
4. Tome un tornillo de tierra recubierto de poli (3,4-etilendioxitiofeno) sulfonato de poliestireno (PEDOT: PSS) (tamaño: # 00, diámetro: 0.047 pulgadas, longitud: 1/8 pulgadas, consulte la Tabla de materiales) con un cable soldado y conéctelo con un conector a la cabecera del amplificador.
5. Humedezca el cráneo en el sitio deseado del orificio y taladre un orificio a alta velocidad con una broca fina y redonda (con un diámetro de 0,4 mm) en el cráneo por encima del cerebelo hasta que la duramadre sea visible. Coloque el tornillo de tierra en el orificio y atorníllelo con un destornillador de precisión hasta que llegue a la parte superior del cerebelo.
   NOTA: El tornillo de cabeza se recubrió por inmersión con una solución PEDOT:PSS que contenía 1% de 3-glicidiloxipropil)trimetoxisilano (GOPS) en peso, seguida de horneado a 140 °C durante 90 min. PEDOT:PSS es un polímero conjugado con una capacitancia volumétrica que se sabe que es biocompatible. GOPS es un reticulante mezclado con PEDOT:PSS para aumentar la estabilidad en medios acuosos (Figura 1).
6. Con la ayuda del marco estereotáxico, mida las coordenadas estereotáxicas para la región cerebral deseada. Por ejemplo, la región de interés es el hipocampo, anteroposterior (AP) -1,8 mm y mediolateral (ML) a 1,8 mm del punto de Bregma según el atlas cerebral para ratones.
   NOTA: Estas son coordenadas para el hemisferio derecho (Figura 1).
7. Adelgace un área del cráneo de aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro por encima de la región objetivo con un taladro dental confiable (consulte la tabla de materiales) ajustado a una velocidad rápida hasta que quede una membrana ósea delgada, bien pulida y transparente.
8. Luego, si el grosor de la membrana ósea es lo suficientemente delgado (<200 μm), haga un pequeño orificio con fórceps delgados y retire suavemente la capa delgada del hueso. Use una aguja con punta de gancho hecha a medida para quitar la duramadre. Minimice el tamaño de la craneotomía y la durotomía para prevenir el desarrollo de edemas y minimizar las pulsaciones cardíacas y/o respiratorias del cerebro.
   NOTA: La craneotomía debe llenarse con una gota de solución salina para evitar que se seque y luego volver a llenarse regularmente durante el experimento (Figura 1).

2. Inserción de la sonda de silicio multicanal

1. Utilice brazos estereotáxicos en un ligero ángulo AP (20°) para que la sonda de silicio deje un amplio espacio para el posicionamiento de los otros dos implantes y tenga el registro y los sitios de inyección del electrodo, la bomba de iones y la micropipeta lo más cerca posible.
   NOTA: Los electrodos, jeringas y bombas de iones se cubrieron con una gota de solución de tinción de DiI (1,1'-dioctadecilo-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato [DiI]), para la visualización post hoc de las trazas de implantación (0,5 mg/ml de DiI en dimetilsulfóxido).
2. Coloque la sonda de silicio en el brazo estereotáxico conectado a un soporte magnético y colóquelo junto al marco estereotáxico. Ajuste el ángulo AP (20°) y luego conecte la sonda al cabezal y al tornillo de tierra.
3. Baje lentamente la sonda de silicio hacia el hipocampo con la ayuda del brazo estereotáxico de precisión micrométrica o un micromanipulador motorizado para evitar movimientos laterales (Figura 1 y Figura 2).
   1. Inicie el software de grabación y registre, con el escenario principal, el amplificador conectado y una computadora, señales neuronales eléctricas mientras mueve la sonda de silicio multicanal desde la parte superior de la corteza hasta alcanzar la posición dorsoventral (DV) objetivo (-1,800 μm de la superficie cortical). Grabe y observe la señal de potencial de campo local (LFP) durante la penetración en la pantalla de la computadora.
      NOTA: Controle el descenso de la sonda para que se mueva lenta y continuamente durante la grabación, para tener un mejor control visual de la penetración y de llegar a la zona objetivo.
   2. Utilice la actividad de ondulación en la capa piramidal de la formación del hipocampo en el LFP registrado como marcador de la zona objetivo.
      NOTA: La actividad de ondulación es visible en uno o dos canales vecinos de la sonda de silicio multicanal (Si) que tiene una distancia de 100 μm entre los sitios de registro (Figura 3).
   3. Registre señales LFP de las capas de la corteza y el hipocampo simultáneamente a través del software del amplificador multicanal (ver Tabla de materiales) con la ayuda de las sondas de Si multicanal (Figura 3).

3. Inserción de la bomba de iones microfluídicos (μFIP)

1. Conecte los tubos (consulte la tabla de materiales) a la entrada del μFIP y llene la sonda con una solución de ácido gamma-aminobutírico (GABA) 0,05 M. Retire los tubos y cierre la entrada con una envoltura de película de parafina. Conecte los cables eléctricos a la unidad de medición de la fuente.
2. Inserte el μFIP con la ayuda del brazo estereotáxico en un ángulo mediolateral (MP) (20°). La sonda de Si permanece insertada durante todo el proceso.
   NOTA: μFIP es muy flexible y puede beneficiarse del apoyo de un pincel pequeño y limpio para mantenerlo recto hasta que llegue a la superficie del cerebro. Después de ese paso, μFIP se puede bajar suavemente con movimientos axiales.
3. Baje el μFIP lentamente con movimientos axiales y nunca deje que se doble durante la trayectoria hasta que alcance la coordenada dorsoventral (DV) (-1.200 μm de la superficie cortical).
   NOTA: Trate de colocar los dos dispositivos (μFIP y sonda de silicio) lo más cerca posible entre sí, considerando la distancia de 300 μm de la salida desde la punta del μFIP.
   PRECAUCIÓN: Evite cualquier problema mecánico entre los dispositivos y sus conectores durante la inserción (Figura 1B y Figura 2B).

4. Preparación de dispositivos para la inducción de convulsiones

1. Cambie la aguja metálica de la jeringa (10 μL) (ver Tabla de Materiales). Retire la parte metálica que sujeta la aguja, coloque y fije la micropipeta (diámetro exterior [OD]: 1,2 mm, diámetro interior [ID]: 0,75 mm, diámetro de la punta: 20–50 μm con ± 0,5 cm de estrechamiento del vástago) y, a continuación, vuelva a colocar el elemento de sujeción de la aguja.
2. Coloque la jeringa y la micropipeta de borosilicato adjunta en un ángulo lateromedial (LM) de 20° para la inyección de 4-aminopiridina (4AP) (50 mM en líquido cefalorraquídeo artificial [ACSF]).
   PRECAUCIÓN: No utilice la aguja metálica de la jeringa ni una micropipeta con una punta superior a 50 μm.
3. Extraiga 500 nL–1 μL de 50 mM 4AP con la ayuda de una bomba de microinyección automatizada.

5. Inserción de la pipeta de vidrio unida a una jeringa para inyección de 4AP

1. Baje la micropipeta de vidrio conectada a la jeringa a la posición DV deseada (-1,500 μm) y luego inyecte 250 nL de la solución de 4AP (Figura 1 y Figura 2). Comience a grabar con el software de grabación. Mire la pantalla y espere a que aparezca el primer pico interictal.
2. Iniciar la administración de GABA por μFIP inmediatamente con la aparición de la primera espiga interictal. Administre GABA aplicando 1 V entre la fuente y el destino durante 100 s seguido de 1 s apagado durante 30 ciclos. Con la ayuda del software de grabación, registre durante un mínimo de 2 h.
   NOTA: La masa total del GABA administrado es de alrededor de 1 nmol (Figura 4).
3. Al final del experimento, retire suavemente las sondas insertadas y el tornillo de tierra, y retire al animal del equipo estereotáxico. Los animales fueron sacrificados con una sobredosis de fármaco (i.p.100mg/kg pentobarbital). La muerte se confirmó por el cese de la respiración y la circulación.

Resultados

Figura 1: Cráneo-durotomía y localización de los implantes en el cerebro del ratón. (A) Vista esquemática de la cirugía, la craneotomía y el objetivo de los implantes en el cerebro del ratón. (B) Utilizó coord...

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