Inyección viral estereotáxica para la edición de genes neuronales dirigidos en el cerebro del ratón

Resumen

Fuente: Fricano-Kugler, C. J., et al. Diseño, envasado y entrega de retro y lentivirus CRISPR de alto título mediante inyección estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la inyección viral estereotáxica para una edición precisa de genes neuronales en el cerebro del ratón. El protocolo garantiza la administración precisa del virus a la circunvolución dentada, lo que permite el etiquetado fluorescente y la eliminación de genes mediada por CRISPR para estudiar los circuitos neuronales, la función de los genes y los mecanismos de la enfermedad in vivo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Inyección estereotáxica

1. Confirme que la ventilación de la sala de cirugía esté abierta para garantizar un flujo de aire adecuado. Prepare al ratón para la cirugía anestesiando con isoflurano al 4% en una cámara de inducción. Después de la anestesia, afeite la cabeza para preparar el lugar de la inyección.
   1. Coloque el mouse en el instrumento estereotáxico usando pinzas para mover la lengua hacia abajo y hacia un lado. Inserte la barra de mordida en la boca hasta que los dientes caigan en la ranura, luego asegure las barras para los oídos. Asegúrese de que el cuerpo del mouse esté sobre la almohadilla térmica y que la nariz esté situada en el cono de la nariz. Dirigir el isoflurano al 4% en el cono de la nariz. Confirme la anestesia pellizcando el pie con pinzas y asegurándose de que no haya un reflejo de sobresalto.
   2. Aplique lágrimas artificiales para lubricar los ojos. Termine de preparar el lugar de la inyección frotando la cabeza afeitada con rondas alternas de povidona yodada y lidocaína.
2. Con un bisturí, corte una pequeña incisión a lo largo del centro del cuero cabelludo. Seque el cráneo con un hisopo y peróxido de hidrógeno si es necesario para ayudar a visualizar el bregma.
   1. Usando un alcance de disección, ubique el bregma en el cráneo y coloque la punta del taladro en el bregma. Ponga a cero (o registre) las coordenadas estereotácticas digitales en los planos x, y y z.
   2. Para asegurarse de que la cabeza esté nivelada en el eje y rostral a caudal, coloque la broca en lambda y nivele la cabeza de modo que la coordenada z sea aproximadamente igual tanto en bregma como en lambda.
   3. Para asegurarse de que la cabeza esté nivelada en el eje x, coloque la broca en y = 1/2 lambda. Asegúrese de que la coordenada z sea igual a 1 mm a cada lado (x = +/-1 mm) de la sutura sagital. Ajuste el cráneo si hay una diferencia en la coordenada z a 1 mm a la izquierda y a la derecha de lambda.
3. Coloque el taladro sobre las coordenadas deseadas. Para la circunvolución dentada, use las coordenadas y = -1.9 de bregma y x = +/- 1.1. Antes de perforar, baje el isoflurano al 2%, luego perfore lenta y cuidadosamente a través del cráneo.
   1. Después de perforar todos los agujeros, coloque la jeringa llena en el instrumento estereotáxico. Centre visualmente la jeringa sobre el orificio y ponga a cero la coordenada z en el cráneo.
   2. Baje lentamente la jeringa a la profundidad z más profunda. Para la circunvolución dentada, las profundidades z son -2.5, -2.4 y -2.3. Comience la inyección a una velocidad de 0,25 μl/min utilizando un inyector estereotáxico.
      1. Una vez completada la inyección en la profundidad Z más baja, espere 1 minuto, luego suba a la siguiente coordenada y comience la inyección nuevamente. Continúe este patrón hasta que se inyecten todas las coordenadas de inyección z. Espere 2 minutos antes de retirar la jeringa después de la última inyección.
         NOTA: No se han observado efectos adversos en el tejido al inyectar hasta 2 μl de virus por hemisferio en el cerebro del ratón.
   3. Repita la inyección para otros pozos.
4. Después de la inyección, retire el ratón del instrumento estereotáxico y sutura el cuero cabelludo con 6-0 suturas de seda. Aplique lidocaína y una crema antibacteriana en la herida.
   1. Inyecte 0,8-1,0 ml de solución salina + ketoprofeno (3-5 mg/kg) por vía intraperitoneal (I.P.) para controlar el dolor. Luego, coloque el mouse en la cámara de recuperación calentada. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No devuelva el animal a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Stereotaxic Surgery Reactivos
Vet-Jeringa el veterinario usa solo T.B. Jeringa 1cc luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurano
Hojas de bisturí de acero inoxidable, #10, paquete de 100	Med-Vet International	JOR580S
ungüento de lágrimas artificiales	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
Solución salina normal	Med-Vet International	DYND500MLSH
aplicadores con punta de algodón	Med-Vet International	CTA6
Ungüento antibiótico triple	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Agujas Paquete suave 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 suturas de seda	Med-Vet International	MV-711