Visualización de redes neuronales y vasculares en un embrión de pollo

En este artículo

Resumen

Fuente: Delalande, J., et.al. Etiquetado dual de células de cresta neural y vasos sanguíneos dentro de embriones de pollo mediante injerto de tubo neural^GFP de pollo e inyección de DiI de colorante de carbocianina. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra el trasplante de un tubo neural de donante marcado con GFP de un embrión de pollo transgénico emparejado por etapas a un embrión receptor al nivel de los somitas uno a siete, seguido de un etiquetado vascular con un tinte fluorescente lipofílico. El enfoque combinado permite la visualización directa del embrión bajo un microscopio de estereofluorescencia, lo que permite el estudio de la integración del injerto neural y el desarrollo de la red vascular en ovo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Injertar el tejido

Con una micropipeta de vidrio, transfiera con cuidado el tubo neural diseccionado del reloj al embrión huésped. Coloque el tubo neural en la orientación anteroposterior correcta y empuje suavemente el explante adyacente a la región extirpada del pollito huésped con el microbisturí. Deje un pequeño fragmento de ectodermo adherido a la superficie dorsal o cortando una pequeña muesca en ella para identificar la orientación del tubo neural.
1. Si es necesario, use el microbisturí para recortar el explante al tamaño exacto de la región extirpada.
Guíe suavemente el tubo neural hacia la región ablacionada y colóquelo de manera que el lado dorsal esté correctamente orientado. Utilice una micropipeta de vidrio, montada en un tubo bucal, para eliminar el PBS y/o el líquido que rodea el injerto. Esto ayuda a que los tejidos del donante y del huésped se adhieran y que el injerto se establezca.
Selle toda la ventana con cinta transparente de 24 mm de ancho para evitar la deshidratación y la contaminación.
Etiquete el embrión quimérico marcando con un lápiz la cáscara del huevo y registre su número en el libro de laboratorio. Regrese el huevo a la incubadora para un mayor desarrollo.

2. Inyecte DiI en los vasos sanguíneos del embrión huésped

En el momento experimental deseado (aquí, de 3 a 10 días después), recupere el embrión quimérico de la incubadora y retire la cinta transparente con unas tijeras rectas para acceder al embrión dentro del óvulo.
Si es necesario, amplíe la ventana en la carcasa con las tijeras. Tenga cuidado de no dañar la membrana corioalantoidea si está adherida a la cáscara, lo que provocaría una hemorragia y pondría en peligro el etiquetado de los vasos sanguíneos.
Elija una vena accesible en la yema asegurándose de que el flujo sanguíneo se dirija hacia el embrión. Elija un punto de ramificación de una de las venas vitelinos (Figura 1B, C).
NOTA: En E6.5 - E7.5, es posible que sea necesario apartar suavemente la membrana corioalantoidea con pinzas para acceder a las venas vitelinas. Después de E8.5, la única opción es inyectar en una de las venas de la membrana corioalantoidea ya que, en esta etapa, la membrana corioalantoidea cubre completamente el embrión.
Retire la membrana vitelina por encima del punto de inyección elegido con dos pinzas Dumont #5 rasgando en direcciones opuestas.
Rompa una aguja de vidrio extraída con un Dumont #5 y ajuste su diámetro al tamaño aproximado de la vena antes de cargarla con CellTracker CM-DiI. Preparar la solución madre de DiI a 40 μg/μl en DMSO y almacenar a -20 °C. Preparar la solución de trabajo en sacarosa 0,3 M/PBS a una concentración de 4 μg/μl.
1. Aspirar entre 5 y 10 μl de DiI en sacarosa 0,3 M/PBS en la aguja mediante succión con un tubo bucal. Los embriones más viejos pueden requerir hasta 25 μl o más. A partir de E8.5, los embriones tienen venas más grandes y musculosas, que pueden necesitar ser mantenidas en posición con un Dumont #5 antes de apuñalar con la aguja de vidrio cargada con DiI.
Inserte rápidamente la aguja en la vena y sople constantemente con el tubo bucal para permitir que el DiI se una al flujo sanguíneo lentamente sin formar un coágulo. Alternativamente, use un inyector de presión para la administración de DiI.

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Resultados

Figura 1. Inyección intravenosa de DiI. (A) Instrumentos recomendados: a) CellTracker CM-DiI gota en parafilm, b) aguja de inyección de vidrio extraído, c) tubo bucal. (B) Diagrama esquemático de la inyección intravenosa de DiI ...