Imágenes in vitro en tiempo real de la ramificación axonal en neuronas corticales de ratón

Resumen

Fuente: Winkle, C. C., et al. Utilización de metodologías combinadas para definir el papel de la administración de membrana plasmática durante la ramificación de axones y la morfogénesis neuronal. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra una técnica de imágenes en vivo que utiliza microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) para observar la ramificación axonal en tiempo real en las neuronas corticales. Los videos de lapso de tiempo capturan los efectos del tratamiento con netrina-1, una molécula de señalización que induce exocitosis localizada y reordenamientos citoesqueléticos en los axones. Estos procesos inician protuberancias de membrana, que se convierten en ramas axonales maduras, lo que proporciona información sobre el desarrollo neuronal.

Protocolo

1. Microscopía de lapso de tiempo de contraste de interferencia diferencial (DIC) de ramificación de axones

Nota: Si bien este protocolo utiliza DIC, se pueden usar otros métodos de microscopía de luz transmitida para los mismos fines (por ejemplo: contraste de fase).

1. A los 2 días in vitro (DIV), coloque una placa de imágenes con fondo de vidrio que contenga neuronas no transfectadas en una cámara ambiental precalentada para mantener un ambiente húmedo con 5% de CO2 y 37 °C. Utilice un microscopio equipado con un apocromático plano de 60X, una lente de objetivo DIC de apertura numérica (NA) de 1,4 y un condensador de alta NA para obtener la mejor calidad y resolución de imagen.
2. Ajuste el plano focal para encontrar neuronas a través de los oculares utilizando iluminación de luz transmitida.
3. Usando la función de adquisición de áreas múltiples en el software de imágenes, encuentre y guarde las ubicaciones XYZ de al menos 6 celdas. Coloque el escenario de modo que las neuronas de interés encajen dentro del campo de visión para obtener mejores resultados.
   1. Estimular con 250 ng/ml netrina-1 y pulsar 'iniciar adquisición multizona'. Adquiera imágenes secuencialmente en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas, pausando la adquisición y reenfocando según sea necesario.
4. Revise imágenes en software de imágenes usando Aplicaciones>Revisar datos multidimensionales>nombre de archivo abierto. Identifique ramas axonales estables (20 μm de largo) que se forman durante la sesión de imágenes. Utilice la herramienta de dibujo de líneas para medir una rama de axón estable desde la base del axón hasta la punta para asegurarse de que se cumple la calificación de longitud de 20 μm.
   1. En una hoja de cálculo, registre el número de fotograma después de la estimulación con netrina cuando se inicien protuberancias de membrana en áreas donde se formen ramas más tarde, así como el número de fotograma después de la estimulación con netrina cuando las ramas nacientes alcancen los 20 μm de longitud.
   2. Multiplique el número de marcos entre la protuberancia y la formación de ramas por 20 segundos para calcular el tiempo de formación por rama.

Materiales