Imágenes in vivo de dos fotones de la dinámica microglial en el hipocampo del ratón

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Imágenes crónicas de dos fotones in vivo de la microglía con ratones CX3CR1-GFP

1. Después de la inducción de la anestesia, lave el interior del tubo de metal con solución salina estéril para eliminar los desechos. Asegúrese de que el alveo blanco del hipocampo sea visible a través del vidrio (Figura 1A) y que no haya complicaciones, como sangrado postoperatorio.
2. Coloque el mouse debajo del microscopio de dos fotones en los siguientes pasos:
   1. Coloque el mouse en el dispositivo de sujeción de la cabeza debajo de la lente del objetivo del microscopio de dos fotones y en la platina de escaneo XY motorizada. Use una almohadilla térmica para soporte térmico. Controle y ajuste la profundidad de la anestesia, ya que este control de calidad puede demorar hasta 30 minutos. nota: Se recomienda la lente del objetivo de inmersión en agua con una distancia de trabajo (WD) superior a 3 mm y una alta apertura numérica (NA). Un collar de corrección de la lente del objetivo puede mejorar la resolución al compensar el desajuste del índice de refracción entre el vidrio y los biomateriales.
   2. Rellene el espacio entre el vidrio y la lente del objetivo con agua, teniendo especial cuidado de evitar burbujas de aire. Si es necesario, expanda el área de la placa de metal con una película de plástico, que retiene más agua, para cubrir toda la lente frontal del objetivo.
   3. Encienda un láser pulsado de femtosegundo de 920 nm de longitud de onda para la excitación de las sondas fluorescentes expresadas en el cerebro e inicie el software de adquisición de imágenes.
   4. Ajuste el enfoque al CA1 (Cornu Ammonis 1) utilizando la platina motorizada y el sistema de enfoque motorizado. Coloque la estructura objetivo con la guía de la fluorescencia emitida por el parénquima cerebral y la luz reflejada desde el borde del tubo de metal bajo iluminación continua del láser pulsado.
   5. Mida las profundidades del parénquima cerebral tocando el fondo de cristal ajustando el enfoque con el sistema de enfoque motorizado. Compare las profundidades en diferentes ubicaciones horizontales para juzgar la alineación del fondo del vidrio y el plano de imagen.
      1. Ajuste el ángulo de la cabeza del ratón inclinando el dispositivo de sujeción de la cabeza hasta que la parte inferior del cristal esté paralela al plano de la imagen.
   6. Ajuste el collar de corrección del objetivo para lograr la resolución más alta a la profundidad de la estructura objetivo en el CA1.
3. Verifique la calidad e intensidad de las imágenes obtenidas por excitación de dos fotones del hipocampo (Figura 1B).
   NOTA: El deterioro de la imagen indica la presencia de daño tisular dentro del cerebro.
4. Asegúrese de que la microglía ya haya recuperado su morfología ramificada (Figura 1C).
   NOTA: Los datos de imagen de la microglía indican que se requieren al menos 3-4 semanas para que la microglía vuelva a su estado basal.
5. Realizar imágenes in vivo en cualquier capa del CA1 para el propósito particular del experimento.

Figura 1: Imágenes in vivo de la microglía en ratones CX3CR1-GFP en la fase crónica.) La apariencia representativa de la ventana implantada en la dorsal derecha CA1 (Cornu Ammonis 1) en la fase crónica. A través del fondo de cristal, las fibras blancas del alveo se observan claramente sin sangrado postoperatorio. El DHC y el VI son parcialmente visibles en el área caudomedial y en el borde rostrolateral, respectivamente. Barra de escala, 1 mm. (B) Reconstrucción 3D representativa de la imagen crónica in vivo de CA1 de un ratón CX3CR1-GFP en POD 24 (ancho: 511 μm, altura: 511 μm, profundidad: 670 μm). (C) Las imágenes típicas de microglía de (B) con morfología ramificada completamente restaurada se muestran como las MIP de las pilas de imágenes de GFP con un espesor de 20 μm a profundidades de 100, 280 y 500 μm de la superficie quirúrgica. Barras de escala, 50 μm.