Obtención de imágenes de transitorios rápidos de calcio en terminaciones nerviosas de ratón mediante microscopía confocal

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal correspondiente.

Se realizaron experimentos en preparaciones aisladas de músculo nervioso del elevador del auris largo (m. LAL) de ratones BALB/C (20-23 g, 2-3 meses de edad).

1. Preparación de las soluciones de Ringer y Filing

1. Prepare la solución de Ringer para el músculo de mamíferos mezclando los siguientes ingredientes: cloruro de sodio, NaCl (137 mM), cloruro de potasio, KCl (5 mM), cloruro de calcio, CaCl₂ (2 mM), MgCl₂ (1 mM), NaH₂PO₄ (1 mM), NaHCO₃ (11,9 mM) y glucosa (11 mM). Burbujee a través de la solución con oxígeno al 95% (O₂) y dióxido de carbono al 5% (CO₂) y ajuste su pH a 7.2-7.4 agregando ácido clorhídrico / hidróxido de sodio (HCl / NaOH) si es necesario.
2. Prepare la solución de carga de tinte.
   1. Prepare una solución de ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) (10 mM) con un pH en el rango de 7,2-7,4. 500 μg de colorante comercial vienen en un vial de 500 μL. Disuelva el colorante en 14 μL de la solución HEPES para obtener una concentración de colorante de 30 mM. Agitar bien y centrifugar hasta que se disuelva totalmente.
   2. Diluya la solución del indicador de Ca²⁺ con solución HEPES hasta una concentración de 1 mM. Guárdalo en un congelador (-20 °C) y evita la exposición a la luz.

2. Procedimiento de carga de colorante

NOTA: El procedimiento de carga de colorante se realiza de acuerdo con el protocolo de carga a través del muñón nervioso, adaptado de los protocolos publicados anteriormente.

1. Diseccionar el músculo LAL de acuerdo con el procedimiento de disección para esta preparación como se describe en los protocolos publicados anteriormente.
   1. Fije el tejido ligeramente estirado (no más del 30% de la longitud inicial) en la placa de Petri recubierta de elastómero con finos alfileres de acero inoxidable y agregue la solución de Ringer hasta que el músculo esté completamente cubierto.
      NOTA: La placa de Petri se llenó previamente con elastómero de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
2. Prepare la pipeta de relleno
   1. Con un extractor de micropipetas (consulte la tabla de materiales), prepare una micropipeta con una punta fina que sea lo más afilada posible para las grabaciones intracelulares. Utilizar capilares sin filamentos internos (1,5 mm de diámetro exterior y 0,86 o 1,10 mm de diámetro interior).
   2. Rompa la punta de la micropipeta después de marcar el cono con un abrasivo, dejando la punta abierta a unos 100 μm de diámetro. Pula la punta al fuego hasta limitar cuando el diámetro interno se reduzca de >80 μm a 12-13 μm. Coloque un tubo de silicona en un lado de la pipeta de llenado y una jeringa (sin aguja) en el otro lado.
3. Bajo un microscopio estereoscópico, encuentre el lugar donde el tronco nervioso se convierte en ramas nerviosas separadas. Coloque la pipeta de relleno con el tubo montado y la jeringa en la placa de Petri con cera. Mueva la punta de la pipeta hasta que quede por encima del nervio.
4. Con unas tijeras finas, corte el nervio cerca de la fibra muscular, dejando un pequeño trozo del muñón del nervio de aproximadamente 1 mm de largo. Aspire suavemente el muñón del nervio junto con un poco de solución de Ringer, sin pellizcarlo, en la punta de la pipeta de relleno. Retire el tubo de silicona de la pipeta de relleno.
5. Extraiga una cantidad de la solución de carga de colorante (~ 0,3 μL) con una jeringa con un filamento largo. Este volumen corresponde a aproximadamente 3 cm del filamento.
   NOTA: Inicialmente, es necesario hacer un filamento a partir de una punta de pipeta con un volumen de 10 μL tirando del fuego con una lámpara de alcohol o un quemador de gas.
6. Inserte suavemente la punta del filamento con la solución de carga en la pipeta de llenado. Suelte la mezcla directamente sobre el muñón del nervio. Incube la preparación a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min.
7. Después de eso, enjuague la preparación con solución de Ringer fresca e incube a 25 ° C durante un máximo de 2 h en un vaso de precipitados de vidrio con 50 ml (o más) de solución de Ringer (la preparación debe cubrirse con la solución). Durante este tiempo, el tinte llegará a las sinapsis.

3. Captura de video con microscopía confocal

NOTA: El registro de transitorios de calcio se realiza con un microscopio confocal de barrido láser (LSCM) (consulte la tabla de materiales). Para registrar transitorios rápidos de calcio, se utilizó un protocolo original que permitía registrar señales con una resolución espacial y temporal suficiente. El microscopio estaba equipado con un objetivo de inmersión en agua de 20x (apertura numérica (NA) de 1,00). La línea láser de 488 nm se atenuó al 10% de intensidad y la fluorescencia de emisión se recolectó de 503 a 558 nm.

1. Monte la preparación en la cámara experimental recubierta de elastómero de silicio y fíjela, ligeramente estirada, con un juego de microagujas de acero. Enjuague la preparación abundantemente con la solución de Ringer.
   NOTA: Se utilizó una cámara experimental de perfusión simple hecha a medida hecha de vidrio orgánico con el fondo de la cámara cubierto con un elastómero (preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante; consulte la Tabla de materiales). La cámara tiene un tubo de suministro de solución. La solución se bombea a través de una aguja de jeringa, montada en un soporte magnético (consulte la tabla de materiales). Como cámara experimental, se podía usar una placa de Petri (como la que se usa para la incubación de la preparación), pero con tubos de suministro y succión adjuntos.
2. Instale un electrodo de succión, que se utilizará para estimular el nervio.
   NOTA: Coloque y fije el electrodo encerrándolo al lado del baño. Mueva la punta cerca del muñón del nervio y aspírela hacia el electrodo.
3. Monte la cámara de preparación en la platina del microscopio y coloque los accesorios de entrada y salida en la cámara.
4. Para perfundir la preparación, utilice un sistema simple impulsado por flujo de gravedad. Encienda la bomba de succión de perfusión para eliminar el exceso de solución.
5. Conecte el electrodo de succión estimulante a un estimulador eléctrico y asegúrese de que se produzcan contracciones musculares después de la estimulación. Consulte las secciones 3.9-3.12 para conocer las condiciones de estimulación y el registro.
6. Llene el sistema de perfusión con la solución de Ringer con d-tubocurarina (10 μM).
   NOTA: Esta solución ayuda a prevenir las contracciones musculares. Los bloqueadores específicos de D-tubocurarina o alfa-bungarotoxina de los receptores nicotínicos de acetilcolina en la membrana postsináptica bloquearían total o parcialmente las contracciones musculares50. Además, para prevenir las contracciones musculares, se podrían utilizar bloqueadores específicos de los canales de sodio postsinápticos como la μ-conotoxina GIIB51.
7. Encienda la bomba de succión de perfusión e inicie la perfusión de la preparación con la solución de Ringer que contiene d-tubocurarina.
8. Establezca los parámetros de imagen en el software LSCM de la siguiente manera.
   1. En el software LSCM (LAS AF; consulte la Tabla de materiales), elija Electrofisiología.
      NOTA: En este modo, cuando se captura una imagen en el punto de tiempo, se envía un pulso de sincronización al estimulador con la ayuda de la caja de activación. Esto provoca la generación de potencial de acción en la preparación (Figura 1; unidad estimuladora).
   2. Seleccione Modo de adquisición. Para activar el estimulador mediante el pulso de sincronización del microscopio, en la configuración del menú Trabajo, seleccione la configuración de Disparo. Establezca el campo Trigger Out On Frame en el canal out1.
   3. Utilice los siguientes ajustes: Modo de escaneo: XYT, Frecuencia de escaneo: 1400 Hz, Factor de zoom: 6.1, Estenopeico: completamente abierto. Asegúrese de que el modo X bidireccional de paso secuencial esté activado.
   4. Establezca el tiempo mínimo para formar un fotograma a 52 ms y los fotogramas que se recopilarán en un video sin procesar a 20 fotogramas.
      NOTA: Esta configuración permite la captura de imágenes con una resolución de 128 x 128 píxeles mientras se toma un solo fotograma cada 52 ms.
   5. Establezca la longitud de onda de excitación del láser de argón a 488 nm con el 8% de la potencia de salida.

Presione el botón Modo en vivo para cambiar al modo en vivo, lo que ayuda a obtener una vista previa de las terminales nerviosas cargadas con el tinte.

9. Unidad de estimulación
   NOTA: Este dispositivo permite establecer parámetros temporales de estimulación a través del software de MATLAB.
   1. Cree un nuevo archivo, pegue el código del artículo mencionado anteriormente en la ventana de código de MatLab y guarde el archivo. Haga clic en Ejecutar, para que aparezca una ventana con parámetros de estimulación. Establezca el tiempo de retardo y la duración del estímulo.
      NOTA: El retardo determina la resolución temporal de la señal fluorescente reconstituida. El pulso eléctrico de 0,2 ms de duración se retrasa y luego se envía a la unidad de aislamiento. Este último forma la amplitud y polaridad del pulso estimulante y aísla eléctricamente el objeto biológico del equipo de grabación.
   2. Para estimular el nervio, seleccione la amplitud supramáxima del impulso estimulante (25%-50% mayor que la intensidad máxima de estimulación necesaria para activar todas las fibras nerviosas).
      NOTA: El método presentado se basa en un algoritmo especial para registrar señales fluorescentes rápidas únicas utilizando LSCM con barrido minimizado. En cada paso del algoritmo desarrollado, la señal fluorescente registrada se desplaza de la anterior en un intervalo de tiempo que es más corto que el barrido del microscopio. El valor de los desplazamientos de tiempo determina la resolución temporal de la señal requerida. El número de pasos (desplazamientos) en el algoritmo depende de la resolución temporal requerida y de la resolución temporal original. Con este método de registro, la estimulación de la preparación se realiza con una frecuencia de 0,25 Hz.
10. En el modo Live, busca el ROI y obtén el mejor enfoque. Ejecute el software de adquisición de datos.
11. Cambie el retraso del estimulador en 2 ms menos en relación con el valor anterior y ejecute el software de adquisición de datos.
12. Repita el paso 3.11 26 veces para adquirir 26 secuencias, con cada secuencia desplazada 2 ms de la anterior.

Figura 1: El esquema de la configuración experimental. 1. Microscopio confocal de barrido láser (LSCM). 2. Módulo de sincronización de LSCM (caja de disparo). 3. Estimulador. 4. Unidad de aislamiento. 5. La muestra biológica. 6. Electrodo de succión para estimulación eléctrica del nervio. 7. Sistemas de perfusión (7a: depósito de perfusión, 7b: gotero, 7c: regulador de flujo, 7d: matraz de vacío). Las flechas apuntan a la dirección de propagación del impulso de sincronización.