Administración de fármacos neuroterapéuticos basados en bomba osmótica en un modelo de ratón desmielinizado

Resumen

Fuente: Wang, X. et. al., Administración de fármacos basada en bombas osmóticas para la investigación de la remielinización in vivo en el sistema nervioso central. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el método para administrar medicamentos neuroterapéuticos utilizando una bomba osmótica en un modelo de ratón desmielinizado. La liberación controlada del fármaco promueve la remielinización mediante la activación de las células productoras de mielina en el cuerpo calloso.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Establecimiento del modelo de ratón de desmielinización inducida por lisolecitina Prepare una

1. solución de lisolecitina al 1% (también llamada L-α-lisofosfatidilcolina) con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
2. Esterilice tijeras, fórceps, hemostáticos curvos y otros instrumentos quirúrgicos mediante esterilización en autoclave. Esterilice el área quirúrgica y coloque sábanas estériles. Todos los materiales y reactivos utilizados para la cirugía deben prepararse asépticamente. Es importante mantener el área quirúrgica estéril durante todo el procedimiento.
3. Anestesiar un ratón C57BL6 del día postnatal 56 (P56) de la siguiente manera.
   1. Coloque el ratón en la cámara de isoflurano de la máquina de anestesia para animales pequeños. Ajuste el flujo de O₂ a 300-500 ml / min y el isoflurano al 3% -4%. Después de suficiente anestesia, cuando el ratón se vuelva inmóvil con una respiración lenta y estable, transfiera el ratón al aparato estereotáxico con una almohadilla térmica.
   2. Cambie la salida de gas de la cámara a la máscara de anestesia y ajuste el isoflurano al 1% -1,5% para mantener al ratón en el estado de anestesia. Espere hasta que el ratón esté completamente anestesiado, luego inyecte ketoprofeno (3-5 mg / kg) por vía intraperitoneal para aliviar el dolor. Antes de la operación, pellizque los dedos de los pies del ratón y verifique su reacción para confirmar que la anestesia se haya realizado correctamente.
   3. Cuando el ratón está anestesiado, no puede regular su temperatura corporal. Por lo tanto, controle y regule la temperatura corporal del ratón durante la cirugía. Cubra la superficie de los globos oculares del ratón con ungüento ocular de eritromicina para mantener los globos oculares húmedos mientras está bajo anestesia.
4. Asegure la cabeza del mouse en el aparato estereotáxico con una barra de dientes y barras para los oídos. (Figura 1A).
5. Usa una navaja de afeitar para eliminar el vello de la parte superior de la cabeza. Desinfecte la piel de la cabeza con tres ciclos de betadine y etanol al 75%. Por cuestiones éticas, cubra el cuerpo del animal excepto el sitio de la cirugía. Con un bisturí, haga una incisión sagital media de 1 cm de largo de la piel desde la base del cuello hasta entre los ojos para exponer el cráneo (Figura 1B).
6. Limpie suavemente la superficie del cráneo con un hisopo de algodón estéril que contenga peróxido de hidrógeno al 30% para visualizar las suturas craneales (Figura 1C). Ajuste la altura de la barra dental y las barras de los oídos para colocar el punto lambda y el punto bregma a la misma altura (es decir, con las mismas coordenadas del eje z cuando la punta de la aguja toca los puntos), de modo que la sutura sagital quede horizontal.
7. Coloque suavemente la punta de la aguja de la jeringa de microlitro (10 μL, 33 G) en el punto de bregma y restablezca las coordenadas x, y y z a 0 (Figura 1D). Mueva la jeringa al lugar de la inyección (x: 1,04; y: 1,0, es decir, 1,04 mm lateral a la línea media y 1,0 mm posterior al punto de bregma) de acuerdo con la indicación de la lectura digital (Figura 1E).
8. Taladre lentamente un pequeño orificio a través del cráneo en el lugar de la inyección sin penetrar la duramadre con una aguja de jeringa de 1 ml (26 G, 0,45 mm) (Figura 1F). Inserte lentamente la aguja de la jeringa de microlitros en el tejido cerebral a través del orificio hasta alcanzar una cierta profundidad (z = -1,62 mm para la mayoría de los ratones P56) (Figura 1G).
   NOTA: Empíricamente, la profundidad de inserción de -1,62 mm permite que la punta de la aguja llegue a la mitad del cuerpo calloso de la mayoría de los ratones P56 para que la lisolecitina pueda administrarse directamente en el cuerpo calloso para inducir la desmielinización.
9. Inyecte 1,5 μL de lisolecitina al 1% a una velocidad de 0,3 μL/min. Después de la inyección, espere 5 minutos antes de sacar lentamente la jeringa de microlitros para evitar fugas de líquido a lo largo de la trayectoria de la aguja de inyección.
10. Sutura la piel con suturas quirúrgicas 5-0 (Figura 1H).
11. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica para evitar una caída de la temperatura corporal. Administrar una inyección subcutánea de 5 mg/kg de carprofeno cada 24 horas para aliviar el dolor. Aplique ungüento de eritromicina a la incisión todos los días para asegurarse de que la herida sane correctamente. Coloque al ratón que se ha sometido a una cirugía solo en una jaula y aliméntelo con comida húmeda hasta que se recupere por completo. Supervise el mouse diariamente después de la operación.

2. Preparación de la bomba osmótica

NOTA: Los componentes clave de la bomba se muestran en la Figura 2A.

1. Determinar la profundidad de inserción de la cánula de infusión cerebral en el cerebro. Asegúrese de que la aguja de la cánula de infusión cerebral utilizada tenga 3 mm de largo y que cada espaciador de ajuste de profundidad sea de 0,5 mm. Para lograr una profundidad de inyección de 1,5 mm (cerca del calloso), coloque tres espaciadores de ajuste de profundidad en la aguja de la cánula de infusión cerebral con adhesivo tisular (Figura 2B, C).
2. Para llenar la bomba osmótica, conecte la aguja de la jeringa que viene con el paquete de la bomba a una jeringa de 1 ml y aspire el medicamento. Sostenga la bomba en posición vertical, inserte la jeringa en la abertura en la parte superior de la bomba e inyecte lentamente el medicamento, teniendo cuidado de no crear burbujas (véase la figura 2D). Cuando el líquido salga por la abertura, saque lentamente la jeringa.
3. Retire la brida blanca del regulador de flujo con tijeras o alicates teniendo cuidado de no doblar ni aplastar el moderador de flujo. Luego, inserte el moderador de flujo en la bomba (Figura 2E). Para determinar si hay burbujas en la bomba osmótica, pese la bomba osmótica por separado antes y después del llenado.
4. Recorte el catéter a una cierta longitud de acuerdo con el tamaño del animal (catéteres de 20-25 mm para ratones P56 que pesan alrededor de 25 g). Conecte el catéter a la cánula de infusión cerebral.
5. Llene el catéter con medicamentos usando la jeringa sin introducir aire (Figura 2F).
6. Conecte el catéter al moderador de flujo. Después de la conexión, asegúrese de que el catéter cubra aproximadamente 4 mm del moderador de flujo expuesto (Figura 2G).
7. Para asegurarse de que la bomba osmótica pueda funcionar instantáneamente después de la implantación, sumerja las bombas llenas en solución salina estéril al 0,9% o PBS a 37 °C durante al menos 4 a 6 h (preferiblemente extienda hasta toda la noche) para humedecer previamente la membrana semipermeable en la superficie de la bomba con soluciones que tengan la misma presión osmótica que el entorno tisular (Figura 2H).
8. Todas las soluciones cargadas en las bombas deben ser estériles. Las bombas ALZET se suministran estériles, habiendo estado expuestas a una dosis esterilizante de cobalto-60. Sin embargo, si se produce contaminación exterior, la superficie de la bomba se puede limpiar limpiándola con alcohol isopropílico (70% en agua).

3. Implantación de la bomba osmótica

1. Esperar 3 días después del establecimiento del modelo de desmielinización del cuerpo calloso. Encienda el sistema de anestesia para animales pequeños. Desinfecte las tijeras, pinzas y alicates hemostáticos y sumérjalos en una solución de alcohol al 75%. Coloque sábanas estériles en el área quirúrgica.
2. Anestesiar y asegurar a los ratones en el aparato estereotáxico nuevamente. Cubra la superficie de los globos oculares con un ungüento para los ojos para evitar la sequedad.
3. Desinfecte la herida original con alcohol al 75%. Abra la incisión quirúrgica que se coturó previamente (Figura 3A) y expanda la incisión hasta los omóplatos (Figura 3B).
4. Separe la piel del tejido conectivo subcutáneo con alicates hemostáticos o pinzas en la escápula para abrir una cavidad (Figura 3C). Coloque la bomba osmótica en la cavidad (Figura 3D, E).
5. Con un hisopo de algodón, limpie suavemente y exponga el orificio en la superficie del cráneo creado al establecer el modelo de desmielinización (consulte el paso 1.8). Inserte la cánula de infusión cerebral a través de este orificio perpendicularmente y asegúrela en el cráneo rápidamente con adhesivo tisular (Figura 3F).
6. Retire la lengüeta extraíble sobre la cánula de infusión cerebral con unas tijeras (Figura 3G, H). Alternativamente, retire la lengüeta primero antes de insertar la cánula para evitar temblar durante este proceso.
7. Coser la incisión o fijarla con adhesivo tisular (Figura 3I).
8. Después de la cirugía, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para evitar una caída de la temperatura corporal. Administrar una inyección subcutánea de 5 mg/kg de carprofeno cada 24 horas para aliviar el dolor. Aplique ungüento de eritromicina a la incisión todos los días para asegurarse de que la herida sane correctamente. Coloque al animal solo en una jaula y aliméntelo con comida húmeda hasta que se recupere por completo.

Resultados

Figura 1: Establecimiento del modelo de ratón de desmielinización inducida por lisolecitina. (A) Asegure el ratón en el aparato estereotáxico. (B) Abra una incisión sagital media de 1 cm para exponer el cráneo. (C...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bomba de aire de anestesia	RWD	R510-29	E05818-006
Kit de infusión cerebral 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofeno	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg cada 24 h
Eritromicina ocular ungüento	Junto con la tecnología	YCKJ-RJ-024780	Cubra la superficie de los globos oculares durante la anestesia
Ungüento de eritromicina	pythonbio	RG180
Aparato de evacuación de gases	RWD	R546W	E05518-002
L-α-lisofosfatidilcolina	Sigma	L0906	Disolver al 1% con una jeringa estéril de
microlitros	Hamilton	65460-05	Serie de jeringas: 1700, 10 μL, calibre 33
Bomba microosmótica modelo 1002	ALZET	4317	0,25 μL por hora, 14 días
PBS (pH = 7,3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sódico	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 mg/kg inyección intraperitoneal para la eutanasia Máquina de
anestesia para animales pequeños	RWD	R520IE	E05807-006 M
Equipo estereotáxico	RWD	E06382
Esterilizador STERI 250	Keller	31101	Esterilización rápida de instrumentos quirúrgicos
Suturas quirúrgicas	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Aguja de jeringa (1 ml)	Shanghai KDL 6930197811018		calibre 26 (0,45 mm x 16 mm)
Prueba de fármaco y disolvente	Sistema	Thermostar Thermostar
	RWD	69026	Mantenga la temperatura corporal durante la anestesia
Adhesivo tisular Vetbond	3M	1469SB	Asegure la cánula de infusión cerebral y adhiera la incisión de la piel

PBS de monitoreo homeotérmico dependiente del experimento