Administración intratecal de un compuesto de prueba al sistema nervioso central de la rata

Resumen

Fuente: Chen, Y., et al. Administración intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de ratas. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra la administración de un compuesto de prueba en el líquido cefalorraquídeo (LCR) a través de un catéter implantado en la columna lumbar de un modelo de rata. El compuesto circula a lo largo del LCR hasta el cerebro y la médula espinal, ingresa a las neuronas y ofrece potencial terapéutico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Cirugía

1. Con la rata sostenida por el tubo cónico de 50 ml, identifique los dos hoyos naturales entre los músculos por encima de la pelvis (flechas en la Figura 1A). Con una mano sosteniendo esos hoyos, use la otra mano para presionar suavemente y sentir la columna vertebral desde la dirección caudal a la rostral y encuentre la primera hendidura importante entre las vértebras, y este es el espacio intervertebral entre las vértebras sacras 1 (S1) y lumbar 6 (L6) (Figura 1B).
2. Muévase ligeramente rostralmente para identificar la siguiente hendidura, el espacio intervertebral entre las vértebras lumbares 5 (L5) y L6, y el lugar de la inyección (* en la Figura 1A). Use un bisturí para hacer una incisión de no más de 2 cm de largo en la piel a lo largo de la línea media desde la rostral hasta la caudal para que el sitio de la inyección esté en el centro de la incisión (línea punteada en la Figura 1A).
3. Use tijeras de disección para diseccionar el tejido conectivo y visualizar la capa muscular. Luego, haga una incisión de 1 cm en la cápsula muscular inmediatamente lateral a la apófisis espinal dorsal de la vértebra lumbar L6.
   NOTA: Los huesos de la vértebra lumbar L6 se pudieron visualizar en este punto.
4. Coloque el conjunto de cánula guía-aguja cerca de la cara anterior de la 6ª vértebra lumbar y empújelo en el espacio intervertebral a lo largo de la cara anterior de la 6ª vértebra para que el extremo de la aguja penetre en el canal espinal. Empuje la cánula guía en su lugar a lo largo de la aguja y retire la aguja 23-G, dejando solo la cánula guía en su lugar.
   NOTA: Es útil usar fórceps romos para ubicar la apófisis dorsal de la vértebra lumbar L6 antes de insertar la aguja. Por lo general, se puede observar líquido cefalorraquídeo (LCR) entrando en el cubo de la aguja (este líquido puede estar teñido con un toque de sangre, pero esto no indica que se haya hecho daño o que la aguja no esté colocada correctamente). Los autores no han visto una gran cantidad de sangre o sangrado severo durante este procedimiento. Si ocurre cualquiera de los dos, se debe contactar a un veterinario para determinar el tratamiento adecuado y si los animales deben ser sacrificados.
5. Inserte el conjunto de alambre del catéter en la cánula guía. Incline hacia abajo el conjunto de alambre del catéter en un ángulo de aproximadamente 45 ° con respecto al canal espinal y fuerce el extremo aproximadamente 0,3 cm en el canal espinal.
6. Retire la cánula guía, dejando el catéter con el alambre del estilete en su lugar. Retire el alambre del estilete aproximadamente a 2,5 cm de la punta intratecal del catéter y avance el catéter hacia el canal espinal hasta que la marca de 2 cm esté en la entrada del canal (apenas visible debajo del músculo), como se muestra en la Figura 2Bvi.
   NOTA: El catéter insertado debe extenderse rostralmente en el espacio subaracnoideo. Una colocación exitosa debe permitir que el catéter se mueva libremente en ese espacio.
7. Retire completamente el alambre del estilete y se puede ver que el LCR ingresa al catéter implantado.
8. Conecte el conjunto del catéter de administración al extremo distal del catéter implantado a través del extremo de la aguja de 30 G (Figura 2Bv, vi).
9. Cargue 60 μL de solución salina estéril en una jeringa de 100 μL (jeringa de lavado). Cargue un bolo de 30 μL del compuesto de prueba (por ejemplo, oligonucleótido antisentido o solución de ASO) en una segunda jeringa (jeringa de inyección).
10. Conecte la jeringa de lavado (cargada con solución salina) al extremo del adaptador de tubo del conjunto del catéter de administración (Figura 2Bv). Inyecte 20 μL de solución salina estéril en el espacio intratecal (lavado previo a la inyección).
11. Conecte la jeringa de inyección (cargada con compuesto de prueba) al extremo del adaptador de tubo del conjunto del catéter de administración (Figura 2Bv). Inyecte 30 μL de compuesto de prueba en el espacio intratecal durante 30 s.
    NOTA: El volumen de inyección de rutina de ASO es de 30 μL para lograr una buena eliminación en la médula espinal y en la corteza. Se ha informado que los volúmenes de inyección pueden afectar la distribución del compuesto, aunque no se han probado diferentes volúmenes de inyección. Si se usa otro compuesto o volumen, la seguridad y la eficacia deben determinarse empíricamente.
12. Repita el paso 1.10 y enjuague el catéter con otros 40 μL de solución salina estéril (lavado posterior a la inyección). Luego, separe el conjunto del catéter de administración del catéter implantado.
    NOTA: Se cree que el lavado previo y posterior a la inyección reduce el secuestro local de los compuestos y mejora su distribución a las estructuras rostrales.
13. Para cortar y sellar térmicamente el catéter implantado de forma aséptica, coloque un par de pinzas de disección estériles en un esterilizador de perlas hasta que estén muy calientes, luego sujete el tubo con el extremo caliente de las pinzas.
    NOTA: Esta acción derrite el catéter. Por lo tanto, el orificio en el tubo se colapsa y todos los lados se pegan entre sí, sellando el tubo de manera aséptica. Luego, se coloca en el espacio subcutáneo.
14. Use suturas de monofilamento absorbibles para asegurar el catéter termosellado restante al tejido conectivo. Luego, use suturas de monofilamento no absorbibles para cerrar la piel sobre el catéter termosellado asegurado.
    NOTA: Los clips para heridas también se pueden usar según lo aprobado por el protocolo del comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC). La técnica es compatible con inyecciones repetidas, aunque solo se ha utilizado para inyecciones únicas en nuestras manos. La viabilidad de las inyecciones repetidas debe evaluarse empíricamente con la aprobación de la IACUC.
15. Use gasa y solución salina para lavar la sangre de la piel y permita que el animal se recupere de la anestesia en una incubadora calentada hasta que se mueva, momento en el que se devuelve a su jaula de origen (dos ratas por jaula).
    NOTA: Cuando realice cirugías en varias ratas el mismo día, limpie las herramientas con agua para extraer la sangre y vuelva a esterilizar con un esterilizador de perlas secas calentadas (durante al menos 20 s, con tiempo para enfriar) entre animales. Se utiliza un nuevo conjunto de instrumentos por cada 5 animales.
16. Monitoree a los animales diariamente durante al menos 3 días después de la cirugía y continúe monitoreándolos semanalmente después de la cirugía, de acuerdo con el protocolo de IACUC.

Resultados

Figura 1: Identificación del lugar de inyección y la línea de incisión. (A) Con el abdomen de la rata sostenido por un tubo cónico de 50 ml, los dos hoyos entre los músculos por encima de la pelvis se ven fácilmente (flechas). (B) Con una mano sosteniend...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BD tubo de PE intramédico	BD	Tubo de polietileno PE50, diámetro 0.023 in	BD 427400 (10 pies, Fischer Scientific 22-204008) o 427401 (100 pies, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD tubo de PE intramédico	BD	Tubo de polietileno PE10, diámetro 0.011 in	BD 427410 (10 pies, Fischer Scientific 14-170-11B) o 4274011 (100 pies, Fischer Scientific 14-170-12B)
Agujas de un solo uso BD PrecisionGlide 30G	BD		BD
305128 Cánula guía	BD	19G x 1 WT (1.1 mm x 25 mm) Aguja	BD 305186
Hamilton jeringa 100 ul	company	Hamilton jeringa 100 ul
Esterilizador de perlas calientes	Fino Esterilizador Science Tools		modelo no. FST 250
Exfoliante de povidona	PDI		S48050
salina	Baxter	Cloruro de sodio 0.9% infusión intravenosa BP 50 ml	Pluma
de bisturí FE1306G Bisturí		desechable	No. 10
Almohadilla térmica para animales pequeños	K&H Manufacturing		Modelo no. 1060
Estilete de alambre	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Paño de toalla quirúrgica	Dynarex		4410
Tijeras quirúrgicas y pinzas	FST y Fisher Scientific
Suturas	Ethicon		4-0 o 5-0
Fuente alternativa de materiales prefabricados y esterilizados para este procedimiento
Catéter dosificador sistema	SAI Instrumentos		RIDC-01
Cánula guía	SAI Sistemas		RIDC-GCA
Catéteres internos	SAI Sistemas		RIDC-INC
Estilete de alambre	SAI Sistemas		RIDC-STY

Hamilton Solución de infusión de infusión de infusión de infusión