Evaluación del tratamiento con plasma a presión atmosférica en células de neuroblastoma privadas de glucosa

Resumen

Fuente: Yan, X., et. al., Nueva aplicación de un chorro de plasma a presión atmosférica como agente neuroprotector contra la lesión inducida por la privación de glucosa de las células SH-SY5Y. J. Vis. Exp. (2017)

El video demuestra la actividad neuroprotectora del tratamiento con plasma a baja presión atmosférica en células de neuroblastoma privadas de glucosa mediante la modulación del estrés oxidativo y la mejora de la viabilidad celular.

Protocolo

1. Tratamiento APPJ (Chorro de plasma a presión atmosférica) de SH-SY5Y

1. Ajuste la distancia entre la boquilla del tubo de cuarzo y la plataforma donde se colocará la placa de 96 pocillos a 3 cm. Asegúrese de que el haz pueda tocar la superficie del medio de cultivo.
   NOTA: La distancia no se mide desde el fondo de la placa. Primero se ajusta a 3 cm entre la boquilla del tubo de cuarzo y la plataforma utilizada para colocar la placa de 96 pocillos.
2. Antes del tratamiento APPJ (chorro de plasma a presión atmosférica), cambie el medio de cultivo en cada pocillo excepto en los pocillos de control a RPMI 1640 sin medio de glucosa.
3. Coloque la placa debajo de la boquilla APPJ y asegúrese de que los chorros puedan disparar verticalmente en cada pocillo.
4. Trate las células en pocillos separados con APPJ durante 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s y 12 s.
   NOTA: APPJ se genera mediante helio ionizante (Figura 1). Las células dañadas por la privación de glucosa se tratan con un flujo de helio de 4 s y 8 s para eliminar los efectos del helio en las células. Todos los tratamientos deben realizarse por triplicado.

2. Ensayo de viabilidad celular

NOTA: No cambie el medio en este paso.

1. Después del tratamiento APPJ, incube las células durante 1 h en una incubadora de células.
2. Agregue 10 μL de solución de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a cada pocillo.
3. Incubar las células a 37 °C durante 4 h.
   NOTA: La línea celular SH-SY5Y es sensible a las condiciones de privación de glucosa. La viabilidad celular disminuye a casi el 50% después de 1 h de privación de glucosa, que es la condición óptima de viabilidad celular para los estudios farmacodinámicos. CCK-8 no tiene citotoxicidad para las células, y las células se incuban con el reactivo CCK-8 durante otras 4 h en las condiciones de privación de glucosa después del tratamiento con APPJ para verificar la viabilidad celular. Después de 8 h de privación de glucosa y tratamiento con APPJ, el efecto protector de APPJ se redujo significativamente porque la larga duración de la privación de glucosa provocó daños graves en las células SH-SY5Y. No hubo evidencia de células vivas después de 24 h de privación de glucosa.
4. Mida la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.

Resultados

Figura 1: Reacciones típicas de RNS (especies reactivas de nitrógeno) y ROS (especies reactivas de oxígeno) en emisiones APPJ (chorro de plasma a presión atmosférica).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SH-SY5Y línea celular	China Center for Type Culture Collection	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 medio	Thermo Scientific	21875091	Almacenado a 4 °C
RPMI 1640 medio sin glucosa	Thermo Scientific		11879020 Almacenado a 4 °C
Suero fetal de terneros	Thermo Scientific	16000044	Almacenado a -20 °C
96 pocillos	Corning	de placa 3599
Kit de recuento de células-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories	CK04	Almacenado a 4 °C
Lector de microplacas	Tecan	M200 Pro	Para medir la absorbancia a 450 nm
Amplificador de potencia de alto voltaje	Trek	PD06087	Para amplificar la potencia
Función Generador de señales	MaZe Electronics Science&Technology	AT30120	Para proporcionar la señal específica
Sonda de alto voltaje	Tektronix	P6015A	Para detectar alto voltaje
Osciloscopio digital	Tektronix	DPO4104B	Para mostrar la señal