Entrega intranasal de ARNip al cerebro del ratón mediante un dispositivo de posicionamiento

Resumen

Fuente: Ullah, I., et.al. Un dispositivo de posicionamiento para la colocación de ratones durante la administración intranasal de ARNip al sistema nervioso central. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra una técnica de administración intranasal precisa para administrar complejos de péptido-ARNip dirigidos a neuronas al cerebro del ratón utilizando un dispositivo de posicionamiento especializado. Los ratones anestesiados se aseguran en una posición con la cabeza hacia abajo y hacia adelante para optimizar la inhalación de ARNip y evitar el drenaje pulmonar. El péptido objetivo facilita la captación mediada por receptores en las neuronas, lo que permite la entrega dirigida de ARNip y el silenciamiento génico en el cerebro.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Posicionamiento del ratón

1. Evaluar el nivel de anestesia mediante reflejo pedal (pellizco firme del dedo del pie) para mantener el plano quirúrgico.

2. Coloque el dispositivo de posicionamiento a una distancia y altura adecuadas para proporcionar un acceso conveniente a todos los reactivos necesarios.

3. Una vez que los ratones estén correctamente anestesiados, levante suavemente cada ratón por el pescuezo con el pulgar y el índice y colóquelo en la silla designada.

4. La posición adecuada del ratón en la silla es muy importante en esta etapa. Coloque la espalda del ratón paralela al respaldo de la silla y a 90° del asiento de la silla. Levante las manos del ratón y deje que el animal se acueste naturalmente en la posición de cabeza hacia abajo y hacia adelante, sin empujar ni presionar, como se muestra en la Figura 1B. Asegúrese de que las extremidades anteriores del ratón brinden un soporte natural mientras el animal está en esta posición relajada, sin ninguna molestia para el ratón.

5. Una vez que los ratones estén colocados correctamente, ata los ratones con el cinturón de la silla e inmediatamente comienza la inoculación intranasal.

2. Entrega intranasal (IN)

NOTA: Este protocolo describe la administración IN de complejos RVG9R: siRNA utilizando el dispositivo de posicionamiento del ratón. Con este protocolo, se puede administrar fácilmente un máximo de 20-30 μL de solución a cada ratón en gotas de 2 μL. Este volumen es menor que el de la cavidad nasal del ratón, que es de 0,032 cm³, por lo que el procedimiento no resulta en obstrucción letal de las fosas nasales o asfixia. Este protocolo permite la inoculación simultánea de al menos cuatro ratones y un máximo de ocho ratones por dispositivo, lo que resulta en una optimización del tiempo y una variabilidad reducida.

1. Tome la micropipeta de 10 μL y ajústela a 2 μL.

2. Cargue la micropipeta con 2 μL de solución compleja RVG9R:siRNA (p. ej., 5,2 μg de siCy5 complejado con 104 μg de RVG9R para el experimento de administración, y 13,5 μg de siSOD1 complejado con 270 μg de RVG9R para el experimento de silenciamiento, en un volumen final de 25 μL de PBS que contiene 5% de glucosa.

3. Mientras sostiene la pipeta en la mano dominante, ajuste la posición colocando un codo en la parte superior de la mesa. Apoye la mano que sujeta la pipeta con la otra mano para evitar movimientos incontrolados durante la administración.

4. Coloque una gota de ~2 μL muy cerca de una fosa nasal para que el ratón pueda inhalar directamente la gota (consulte la Figura 1B). Si no se forma fácilmente una pequeña gota, sustituya la punta de la pipeta por una nueva y repita la operación. Utilice el cronómetro para verificar el intervalo de tiempo entre inoculaciones.

5. Este dispositivo permite el tratamiento de al menos cuatro ratones a la vez. Si se requiere que otro grupo de ratones repita el paso 2.4, coloque otra barra con cuatro sillas por encima o por debajo de la primera barra con cuatro sillas para acomodar hasta ocho ratones a la vez en el dispositivo.

6. Repita el paso 2.4 con la otra fosa nasal después de 3-4 min desde la primera inoculación. Este intervalo de tiempo es suficiente para que el ratón complete la inhalación de la primera dosis y restablezca la respiración normal. Si se desprende una gota de la solución inhalada debido a un resoplido accidental de la narisina del ratón, recinecule 2 μL adicionales de solución.

7. Repita todo el proceso con fosas nasales alternas hasta que finalice la dosis de 20-30 μL. Tomará ~ 30-45 minutos completar todo el procedimiento de inoculación.

8. Ponga ungüento húmedo en los ojos de los ratones antes de devolverlos a sus jaulas designadas.
NOTA: No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.

Resultados

Figura 1: Presentación fotográfica del procedimiento de inoculación de IN utilizando el dispositivo de posicionamiento. (A) Equipo experimental requerido para la inoculación de IN. (B) Animales en la posición de cabeza hacia abajo y hacia adelan...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cepa
Balb/c	Orient Bio	N/A	6-8 semanas de edad, 20-30g
Péptidos
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRRRR
Software, algoritmos y dispositivos
Dispositivo de posicionamiento del ratón	Signet Biotech	N/A
Oligonucleótidos y cebadores
siSOD1	ST Pharm	N/A	Sentido: 5'- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1
cebadores	ST Pharm	N/A	F: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'

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