Imágenes in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas mediante microscopía epifluorescente

Resumen

Fuente: Fowler, B. E., et al. Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas del ratón a los estímulos gustativos. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra un protocolo para administrar saborizantes al ganglio geniculado expuesto quirúrgicamente en un ratón anestesiado y usar fluorescencia GCaMP con microscopía epifluorescente para visualizar respuestas neuronales en tiempo real, lo que ayuda a los estudios sobre el procesamiento de señales de sabor periféricas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Ejecute tastant panel
   1. Use succión para eliminar el líquido de encima del geniculado. Opcionalmente, coloque un punto absorbente para ayudar a mitigar las filtraciones y ayudar en la navegación del microscopio.
   2. Coloque al animal en una almohadilla absorbente bajo el microscopio. Localice el ganglio geniculado: los puntos de referencia útiles incluyen el orificio que queda en la bulla, el orificio en el hueso temporal y el séptimo nervio. Usando el filtro FITC/GFP (isotiocianato de fluoresceína/proteína fluorescente verde) en el endoscopio de epifluorescencia, verifique si hay neuronas ganglionares geniculadas que expresan GCaMP individuales. Un objetivo de 10x (distancia de trabajo de 10 mm) proporcionará una resolución suficiente para rastrear la actividad de las células individuales, pero también se puede usar un objetivo de 20x (distancia de trabajo de 12 mm).
   3. Coloque la aguja dispensadora para la línea de sabor firmemente en la boca del animal. Coloque una placa de Petri debajo de la boca del animal para recoger el líquido.
   4. Asegúrese de que la cámara esté viendo el campo de visión del microscopio. Sincronice el inicio de la grabación de video con el inicio de la presentación de sabor.
   5. Durante la grabación, mire la transmisión en vivo para ver las respuestas, la deriva y la filtración.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1ml Jeringa con cierre luer	Fisher Scientific	14-823-30
Aguja dispensadora roma de calibre 27	Scientific	NC1372532
Puntos absorbentes	Fisher Scientific	50-930-668
Acesulfamo K	Fisher Scientific	A149025G
BD Bandejas de Alergista con Aguja Permanentemente Adjunta	Fisher Scientific	14-829-6D
Retractores de romo	FST	18200-09
Placa de pruebas	Thor Labs	MB8
Soporte de poste de cabeza personalizado	eMachineShop		Ver archivo adjunto 202410.ems
Poste de cabeza de metal personalizado	eMachineShop		Ver archivo adjunto 202406.ems
Controlador de temperatura de CC	FHC	40-90-8D
Cámara digital, microscopio sCMOS OrcaFlash4 montado	Hamamatsu	C13440
Visor de disección	Leica	M80
LED Fuente de luz fría	Leica Mcrosystems	KL300LED
Adaptadores de tubo Luer Lock 1/16"	Fisher	01-000-116
Microscopio	Olympus	BX51WI
Mini-series Postes	ópticos Thorlabs	MS2R
placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875713A
Aire presurizado	Airgas	AI Z300
Etiquetado autoadhesivo Cinta	Fisher Scientific	159015R
Tubo de válvula de pellizco de silicona 1/32" x 1/16" o.d. (por pie)	Automate Scientific	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
Tijeras finas para estudiantes	Fine Science Tools	91460-11
Sonda quirúrgica	Roboz Surgical Store	RS-6067
Soporte para sonda quirúrgica	Roboz Surgical Store	RS-6061
BD Intramedic Tubing	Fisher Scientific	22-046941
Regulador de gas de dos etapas	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon vinyl tubing - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Controlador digital/manual Valvelink8.2	Automate Scientific	01-18
Valvelink8.2 Sistema de perfusión de válvula de pellizco	Automate Scientific	17-pp-54
Xilacina	Anased	NADA# 139-236

Fisher