Obtención de imágenes de liberación de neurotransmisores mediante reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Implantación de CNiFER en la corteza del ratón

1. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas en un autoclave antes de la cirugía. Prepare un campo semiestéril para la cirugía limpiando con etanol al 70% y colocando un pañal de laboratorio limpio.
2. Prepare la pipeta de inyección CNiFER tirando de un capilar de vidrio (diámetro interior de 0,53 mm) en un extractor de electrodos vertical. Use un par de pinzas de punta fina no. 5 para romper la punta del electrodo a un diámetro de ~ 40 μm.
   Nota: Esto se logra mejor bajo un microscopio de zoom estéreo con una retícula.
3. Anestesiar a un ratón adulto (día postnatal 60-90) C57BL/6 con isoflurano: 4% (v/v) para inducción y 1,5 a 2,0% (v/v) para mantenimiento. Use pellizcar la cola o el dedo del pie para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado.
   Nota: Vuelva a pellizcar periódicamente y evalúe las contracciones de los bigotes durante la cirugía para reevaluar la profundidad de la anestesia.
4. Cubra los ojos con ungüento oftálmico para evitar que se sequen. Monte el mouse en un marco estereotáxico con barras para los oídos. Mantenga la temperatura corporal del ratón a 37 °C utilizando una almohadilla térmica regulada por una sonda rectal.
5. Afeite un área de aproximadamente 5 mm por 12 mm con una afeitadora eléctrica para animales. Aplique Betadine seguido de isopropanol al 70% (v/v). Use una hoja de bisturí para cortar y quitar la piel sobre la superficie del cráneo. Use una hoja de bisturí para quitar el periostio de la superficie del cráneo. Exponer y limpiar la superficie del cráneo, como se describe para la cirugía estereotáxica.
6. Baje una pipeta de vidrio vacía a bregma y registre las coordenadas antero-posterior (A/P) y medio-lateral (M/L). Refiriéndose al atlas del cerebro del ratón, calcule la posición del lugar de inyección. Cambie la pipeta al sitio objetivo y marque el cráneo para la posterior formación de ventanas.
   Nota: El sitio de inyección y la ventana dependen de la región a estudiar y de la distribución de las proyecciones de liberación de neurotransmisores o péptidos en la corteza. Por ejemplo, en una publicación reciente, las coordenadas estereotáxicas +1.0 a +2.0 mm A / P y +1.0 a +2.0 mm M / L se utilizaron para inyectar células CNiFER en la corteza frontal para obtener imágenes in vivo de la liberación de dopamina durante el condicionamiento clásico.
7. Forme una ventana de cráneo adelgazado de 2 mm x 3 mm.
   Nota: El hueso de la ventana debe tener un grosor de 15-20 μm. Las pequeñas manchas blancas en el hueso no deben ser visibles cuando se humedece la superficie del cráneo, si el hueso está lo suficientemente delgado.
8. Coloque una esponja empapada en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) en la ventana para mantenerla húmeda mientras prepara las células para inyectar.
9. Cosecha el clon de CNiFER que se cultivó en un matraz T75 hasta ~80% de confluencia. Aspire el medio y lave las células con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Nota: La tripsina se omite para estos pasos.
10. Retire el PBS y use 10 ml de ACSF para desalojar las células del fondo del matraz. Triturar células para disociar grupos celulares. Centrifugar y resuspender el pellet en 100 μl de ACSF. Centrifugar durante 30 segundos a 1.400 x g y retirar el sobrenadante, dejando un gránulo cubierto de ACSF. Este paso deja un grupo de celdas en suspensión.
11. Rellene la pipeta de inyección preparada en el paso 1.2 con aceite mineral, cargue la pipeta en un nanoinyector y avance el émbolo para expulsar una pequeña gota de aceite. Coloque 5 μl de suspensión celular CNiFER en una tira de película de parafina plástica cerca de la preparación del ratón. Extraiga las células CNiFER o las células CNiFER de control en la pipeta extraída.
12. Mueva la pipeta a las coordenadas X e Y de destino, es decir, A/P y M/L indicadas en el paso 1.5. Baje la pipeta, perforando el cráneo adelgazado, y continúe hasta ~ 200-400 μm por debajo de la superficie del cráneo, para depositar células CNiFER en las capas 2/3 de la corteza.
13. Inyecte ~ 4.6 nl de células CNiFER en el sitio más profundo con el nanoinyector, observe el movimiento en la interfaz de aceite y celda y luego espere 5 minutos para que las celdas se dispensen. Retire la pipeta ~100 μm e inyecte otros ~4,6 nl de células CNiFER, espere 5 min. A continuación, retire la pipeta lenta y suavemente para evitar el reflujo de los CNiFER. Repita las inyecciones en uno o más sitios adyacentes.
14. Repita los pasos de inyección 1.8-1.12 con células HEK293 de control (es decir, clon HEK293 / TN-XXL / Gqi5 que carece del receptor acoplado a proteína G [GPCR]). Separe los sitios de inyección de CNiFER y células de control en ~ 200 μm.
15. Después de completar las implantaciones celulares, enjuague la ventana del cráneo adelgazado con ACSF y espere a que el cráneo se seque. Aplique una gota de pegamento de cianoacrilato (ver Materiales) sobre la ventana y coloque rápidamente una cubierta de vidrio estéril precortada encima del pegamento. Empuje suavemente el cubreobjetos contra el cráneo durante unos segundos. Deja que el pegamento se seque durante 2 min.
16. Selle los bordes del vidrio de cobertura con cemento dental y forme un pozo alrededor de la ventana para retener agua para el objetivo de inmersión.
17. Para inmovilizar la cabeza del ratón durante la obtención de imágenes, coloque una barra de cabeza hecha a medida con una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato detrás de la ventana. Deje que el pegamento se seque completamente y luego agregue cemento dental adicional para reforzar aún más la barra de cabeza hecha a medida.
18. Cubra el resto de la superficie del cráneo, excepto la ventana, con una capa de cemento dental. Asegúrate de que los bordes de la piel estén cubiertos por cemento y déjalo secar durante 20 min.
19. Después de la cirugía, suspenda la administración de isoflurano y deje al ratón sobre una almohadilla térmica en una jaula hasta que se recupere por completo de la anestesia. Inyecte glucosa al 5% (p/v) en solución salina (subcutánea [s.c.]) para la rehidratación y de 0,05 a 0,1 mg/kg de buprenorfina (intraperitoneal [i.p.], liberación instantánea) para la analgesia postoperatoria.
    Nota: Para minimizar la posible reacción inmunológica a los CNiFER humanos, inyecte al ratón diariamente 20 μl/100 g de ciclosporina (i.p.) a partir del día anterior a la inyección de CNiFER.
20. Regrese al ratón a su jaula de origen para obtener comida y agua.

2. Imágenes in vivo de clones de CNiFER

Nota: Las imágenes en vivo se realizan con ratones utilizando un microscopio de dos fotones y un aparato fijo en la cabeza. No se necesita anestesia durante las sesiones de imágenes. Cuando tome imágenes de animales en estado despierto, limite el reposacabezas a solo unas pocas horas a la vez para reducir los niveles de estrés. Devuelva al animal a su jaula de casa entre sesiones de imágenes para obtener comida y agua. El estrés potencial se minimiza oscureciendo las luces de la habitación y la parte circundante del mouse en un recinto.

1. Al día siguiente de la cirugía, monte el ratón en una plataforma de imágenes atornillando la barra metálica implantada en el cráneo al marco de fijación de la cabeza.
   Nota: Al obtener imágenes de ratones despiertos, la sesión de imágenes no debe exceder unas pocas horas debido al estrés potencial inducido por el dispositivo de sujeción de la cabeza.
2. Coloque la plataforma de imágenes con el mouse con cabeza restringida en un microscopio de imágenes de dos fotones equipado con objetivos de inmersión en agua 10X (0,30 NA) y 40X (0,80 NA).
3. Inserte un cubo de filtro para imágenes de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) (proteína fluorescente cian mejorada [eCFP] y citrino) que tiene un espejo dicroico a 505 nm y filtros de paso de banda que abarcan de 460 nm a 500 nm para medir eCFP y de 520 nm a 560 nm para medir citrino.
4. Agregue ACSF al pozo que contiene la ventana de cráneo adelgazado y baje el objetivo de inmersión en agua en el ACSF. Use el ocular junto con una lámpara de mercurio y un cubo de filtro de proteína fluorescente verde (GFP) para ubicar la superficie de la corteza y la vasculatura debajo de la ventana.
   Nota: El patrón de la vasculatura ayuda a localizar y obtener imágenes de la misma región durante días repetidos de imágenes. Cambie al objetivo de inmersión en agua 40X para localizar CNiFER enfocando manualmente la superficie de la corteza sobre las células utilizando el cubo de filtro GFP y una lámpara de mercurio.
5. Configurado para imágenes de dos fotones. Seleccione la ruta de luz adecuada para la obtención de imágenes de dos fotones. Para un sistema comercial típico, use el software para cambiar al modo de imágenes de dos fotones y redirigir la luz a los tubos fotomultiplicadores (PMT) en los detectores no escaneados. Encienda el láser pulsado de femtosegundo de infrarrojo cercano, seleccione una longitud de onda de 820 nm y un ajuste de potencia del 5-15%.
   Nota: La potencia del 5% generalmente proporciona ~ 25 mW en la muestra.
6. Establezca el voltaje PMT1 y PMT2 cerca del valor máximo, generalmente 700-1,000 V dependiendo del PMT. Establezca la ganancia en 1 para cada canal y ponga a cero la posición z para el objetivo.
7. Baje el objetivo de ~ 100 a 200 μm de la superficie cortical e inicie el escaneo x-y. Ajuste la potencia del láser, la ganancia y el voltaje PMT para cada canal, es decir, eCFP y citrino, para optimizar la relación señal-ruido de la fluorescencia CNiFER.
8. Utilice la función de zoom del software para restringir la imagen a una región que contenga las celdas CNiFER, así como a una región de fondo. Utilice una velocidad de escaneo no inferior a un fotograma cada 2 segundos (0,5 Hz) a 4 μs por píxel. Ajuste el promedio de línea para una relación señal-ruido adecuada, por ejemplo, el promedio de 2 líneas de Kalman.
9. Dibuje una región de interés (ROI) alrededor de las células CNiFER, rodeando aproximadamente de 3 a 4 células por plano. Configure un análisis en tiempo real de las intensidades promedio de ROI. Inicie la adquisición para monitorear la fluorescencia de CNiFER a lo largo del tiempo.
10. Recolecte la fluorescencia de los CNiFER antes y durante las manipulaciones experimentales, por ejemplo, estimulación eléctrica, estimulación de canalrodopsina-2 (ChR2), comportamiento, según lo determine el usuario.
11. Cuando se complete el experimento de imágenes, devuelva el ratón a su jaula de origen. Repita las imágenes a lo largo de los días, según lo desee. Al volver a obtener imágenes, las células se refieren a la imagen de vasculatura de bajo aumento adquirida previamente para orientarse hacia el mismo campo de imagen (paso 2.4).
    Nota: Los CNiFER implantados se pueden visualizar durante al menos 7 días.