Aislamiento y purificación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina recombinante

Resumen

Fuente: Jain, R. W., et al. Producción y purificación simples y eficientes de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina de ratón para estudios experimentales de encefalomielitis autoinmune. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra el aislamiento y la purificación de MOGtag, una glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) recombinante utilizada en estudios experimentales de encefalomielitis autoinmune (EAE). El protocolo implica lisis bacteriana, sonicación, centrifugación y cromatografía de afinidad de níquel para obtener MOGtag purificado. Esta proteína permite la investigación de la autoinmunidad mediada por células B en modelos de esclerosis múltiple.

Protocolo

1. Cosecha de proteína MOGtag

NOTA: En esta etapa, las bacterias habrán producido grandes cantidades de proteína MOGtag. Para cosechar MOGtag, las bacterias se lisan primero en un tampón Triton X-100, seguido de la sonicación. A continuación, MOGtag se libera de los cuerpos de inclusión y se desnaturaliza con imidazol y guanidina, lo que da lugar a una solución de proteína cruda que contiene la proteína MOGtag.

1. Tome una alícuota de 1 ml de uno de los cultivos nocturnos y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Peletizar las células a 16.000 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante. Etiquete el tubo TO/N (post-inducción), luego coloque el gránulo bacteriano en un congelador a -20 °C para futuros análisis de páginas SDS (Figura 2).
2. Distribuya los cultivos uniformemente entre botellas de 250 ml compatibles con centrifugación de alta velocidad y manténgalas en hielo a partir de este momento. Granular las células bacterianas a 22.000 x g durante 15 min a 4 °C.
3. Deseche el sobrenadante. Almacene los gránulos bacterianos a -20 °C o continúe con el paso 1.4.
4. Preparar tampón de lisis (0,1 mg/ml de lisozima de huevo de gallina, 0,1% de Triton-X (v/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) añadiendo 60 μl de Triton X-100 y 120 μl de solución madre de lisozima de huevo de gallina 50 mg/ml a 60 mL de PBS.
5. Vuelva a suspender y combine todos los gránulos bacterianos del paso 1.3 en un total de 30 ml de tampón de lisis. Transfiera este volumen a un tubo de fondo redondo de 50 ml capaz de centrifugar a alta velocidad. Coloque este tubo en un baño de agua a 30 °C durante 30 min. Durante el tiempo de incubación, agite el tubo dos veces para volver a suspender las células.
6. Después de la incubación, transfiera el tubo al hielo y sonique la solución a 20 kHz, amplitud 70%, pulso encendido durante 3 segundos, pulso apagado durante 3 segundos y cinco pulsos por ronda. Sonica la solución durante seis rondas en total y deja que la solución se enfríe en hielo entre rondas.
7. Centrifugar la solución a 24.000 x g durante 15 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y repetir los pasos 1.5-1.7 una vez. Guarde el pellet a -20 °C o continúe con el paso 1.8.
8. Preparar tampón A (500 mM de NaCl (cloruro de sodio), 20 mM de Tris-HCl (clorhidrato de Tris (hidroximetil)aminometano), 5 mM de imidazol, pH 7,9) añadiendo 0,8766 g de NaCl, 0,09456 g de Tris-HCl y 0,01021 g de imidazol a un vaso de precipitados de 100 ml. Agregue agua hasta que el volumen alcance los 28 ml, luego ajuste el pH de la solución a 7.9. Luego, transfiera la solución a un cilindro graduado de 100 ml y agregue agua hasta que el volumen sea de 30 ml.
9. Vuelva a suspender el gránulo del paso 1.7 en 30 ml de tampón A e incube esta solución a 4 °C durante 3 horas. Durante este tiempo, pesar 17,2 g de guanidina-HCl.
10. Sonicar la solución en hielo con los mismos ajustes que en el paso 1.6. Luego agregue 17,2 g de guanidina-HCl a la solución. Incube esto en hielo durante 1 hora para solubilizar la proteína MOGtag.
11. Centrifugar la solución a 24.000 x g durante 30 min a 4 °C. Recoger el sobrenadante y almacenar el sobrenadante a 4 °C hasta la purificación de la proteína.

2. Purificación de proteínas

NOTA: En los siguientes pasos, la proteína MOGtag se purificará a través de 4 rondas de absorción en resina de níquel cargada (a través de la etiqueta His) y la elución.

1. Prepare los siguientes tampones:
   1. prepare el tampón B (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM de imidazol, 6 M de guanidina-HCl, pH 7,9). Agregue 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 0,0681 g de imidazol y 114,64 g de guanidina-HCl a un vaso de precipitados de 500 ml. Luego agregue agua hasta que alcance los 190 ml y ajuste el pH a 7,9. Transfiera la solución a un cilindro graduado de 250 ml y agregue agua hasta que el volumen sea de 200 ml.
   2. Prepare el tampón de elución (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 0,5 M de imidazol, 6 M de guanidina-HCl, pH 7,9). Agregue 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 6,808 g de imidazol y 114,64 g de guanidina-HCl a un vaso de precipitados de 500 ml. Agrega agua hasta que alcance los 190 ml y ajusta el pH a 7,9. Transfiera la solución a un cilindro graduado de 250 ml y agregue agua hasta que el volumen sea de 200 ml.
   3. Prepare el tampón de tiras (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 100 mM de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), pH 7,9). Añadir 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 40 ml de EDTA 500 mM a un vaso de precipitados de 500 mL. Agrega agua hasta que alcance los 190 mL y ajusta el pH a 7.9. Transfiera la solución a un cilindro graduado de 250 ml y agregue agua hasta que el volumen sea de 200 ml.
   4. Prepare el tampón de carga (sulfato de níquel 0,1 M). Añadir 5,257 g de sulfato de níquel a un vaso de precipitados de 500 ml y añadir agua hasta alcanzar los 190 ml (PRECAUCIÓN, no manipular el sulfato de níquel fuera de una campana extractora hasta que el sulfato de níquel se haya disuelto en agua). Una vez que el sulfato de níquel se haya disuelto, transfiera la solución a un cilindro graduado de 250 ml y agregue agua hasta que el volumen alcance los 200 ml.
2. Divida 10 ml de resina de níquel en dos tubos de centrífuga cónicos de 50 ml capaces de soportar fuerzas centrífugas de más de 4.500 x g (5 ml en cada tubo).
3. Cargue y equilibre la resina de níquel:
   1. Lave la resina añadiendo 40 ml de agua a cada tubo que contenga la resina. Coloque los tubos horizontalmente sobre un balancín y déjelos agitar durante 5 min a 4 °C. Una vez terminado, centrifugar los tubos a 4.500 x g durante 8 min a 4 °C.
   2. Deseche el sobrenadante pipeteando para evitar alterar el sedimento. Agregue 40 ml de tampón de carga a cada tubo. Transfiera los tubos a un balancín y déjelos agitar durante 15 min a 4 °C. Una vez terminado, centrifugar los tubos a 4.500 x g durante 8 min a 4 °C.
   3. Deseche el sobrenadante, luego agregue 40 ml de tampón B a los tubos. Transfiera los tubos a un balancín y déjelos agitar durante 5 minutos a 4 °C. Una vez terminado, centrifugar los tubos a 4.500 x g durante 8 min a 4 °C, luego desechar los sobrenadantes.
4. Opcional: Tome 150 μl de la proteína solubilizada recogida en el paso 1.11 y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiquete el tubo como preincubación y congélelo a -20 ° C para un futuro análisis de página SDS (dodecil sulfato de sodio) (Figura 2, MOGtag crudo).
5. Purifique la proteína MOGtag:
   1. Transfiera todo el volumen de proteína solubilizada del paso 1.11 (~40 ml, menos la pequeña muestra extraída en el paso 2.4) al primer tubo (Figura 1, tubo 1) que contiene resina de níquel del paso 2.3, mezcle y coloque horizontalmente en un balancín a 4 °C durante 1 hora.
   2. Centrifugar el tubo a 4.500 x g durante 8 min a 4 °C. Una vez terminado, transfiera el sobrenadante al segundo tubo (Figura 1, tubo 2) de resina de níquel e incube como se describe en el paso anterior. Mientras tanto, continúe con los pasos 3 a 6 a continuación con el tubo 1.
   3. Vuelva a suspender la resina de níquel en el tubo 1 en 40 ml de tampón de elución y coloque el tubo horizontalmente sobre un balancín a 4 °C durante 5 min. A continuación, centrifugar el tubo a 4.500 x g durante 8 min a 4 °C.
   4. Transfiera el sobrenadante que contiene la proteína MOGtag eluida a un frasco de 250 ml etiquetado como "proteína MOGtag purificada" y mantenga este frasco a 4 °C. Con cada paso de elución, agrupe el sobrenadante resultante en esta botella.
   5. Añadir 40 ml de tampón de tiras a la resina de níquel y colocar horizontalmente sobre un balancín durante 5 min a 4 °C.
   6. Centrifugar el tubo a 4.500 x g durante 8 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y, a continuación, recargar la resina de níquel como se indica en el paso 2.3.
   7. Una vez terminado, avance con el segundo tubo como se indica en el paso 2.5. Un total de 4 rondas de absorción de la proteína solubilizada desde el paso 1.11 sobre la resina de níquel cargada y la elución recuperarán la mayor parte de la proteína, aunque, si se desea, se podría recuperar proteína adicional en rondas adicionales de absorción y elución.
6. Una vez completadas cuatro (o más) rondas de absorción y elución, almacene la proteína purificada combinada a 4 °C durante la noche. La resina de níquel se puede almacenar en 40 ml de una solución de etanol al 20% a 4 °C hasta que se necesite nuevamente.

Resultados

Figura 1: Descripción general de los pasos necesarios para producir la proteína MOGtag pura. Para generar la proteína MOGtag, las bacterias que expresan la proteína MOGtag se cultivan a altas densidades y luego se inducen a e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Estas bacterias son necesarias para producir la proteína MOGtag. Las existencias de glicerol de estas bacterias están disponibles a pedido.
Molinero de caldo LB	Bioshop	LBL407.1
Ampicilina	Bio basic	AB0028	Reconstituir el polvo en etanol al 50%/ H₂O al 50% a 100 mg/ml. Conservar a -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconstituya el polvo en H₂O a 1M y guárdelo a -20 °C.
Lisozima de huevo y gallina	Bioshop	LYS702.10	Reconstituir en H₂O a 50 mg/ml y almacenar a -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Solución salina tamponada con fosfato	Life technologies	20012-027	No se requiere solución salina tamponada con fosfato comercial, cualquier solución salina tamponada con fosfato estándar fabricada en laboratorio es suficiente.
Cloruro de sodio	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazol	Bioshop	IMD508.100
Guanidina-HCl	Sigma	G3272	La calidad debe ser superior al 98% de pureza.
0,5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Sulfato de níquel (II)	Bioshop	NIC700.500
Resina aglutinante	His EMD Millipore	69670-3	Almacenar en etanol al 20% 80% H₂O a 4 °C
Etanol anhidro	Alcoholes comerciales	P016EAAN	Diluir con agua según sea necesario.
Ácido acético glacial	Bioshop	ACE222.1
Acetato de sodio trihidrato	Bioshop	SAA305.500
Albúmina sérica bovina estándar	bio-rad	500-0206
Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada Fisher	scientific	BP120-500
Polietilenglicol 3350	Bioshop	PEG335.1
polietilenglicol 8000	Bioshop	PEG800.1
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Dodecil sulfato de sodio	Bioshop	SDS001