Aislamiento y purificación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina recombinante

Resumen

Fuente: Jain, R. W., et al. Producción y purificación simples y eficientes de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina de ratón para estudios experimentales de encefalomielitis autoinmune. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra el aislamiento y la purificación de MOGtag, una glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) recombinante utilizada en estudios experimentales de encefalomielitis autoinmune (EAE). El protocolo implica lisis bacteriana, sonicación, centrifugación y cromatografía de afinidad de níquel para obtener MOGtag purificado. Esta proteína permite la investigación de la autoinmunidad mediada por células B en modelos de esclerosis múltiple.

Protocolo

1. Cosecha de proteína MOGtag

NOTA: En esta etapa, las bacterias habrán producido grandes cantidades de proteína MOGtag. Para cosechar MOGtag, las bacterias se lisan primero en un tampón Triton X-100, seguido de la sonicación. A continuación, MOGtag se libera de los cuerpos de inclusión y se desnaturaliza con imidazol y guanidina, lo que da lugar a una solución de proteína cruda que contiene la proteína MOGtag.

1. Tome una alícuota de 1 ml de uno de los cultivos nocturnos y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Peletizar las células a 16.000 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante. Etiquete el tubo TO/N (post-inducción), luego coloque el ....

Resultados

Figura 1: Descripción general de los pasos necesarios para producir la proteína MOGtag pura. Para generar la proteína MOGtag, las bacterias que expresan la proteína MOGtag se cultivan a altas densidades y luego se inducen a e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Estas bacterias son necesarias para producir la proteína MOGtag. Las existencias de glicerol de estas bacterias están disponibles a pedido.
Molinero de caldo LB	Bioshop	LBL407.1
Ampicilina	Bio basic	AB0028	Reconstituir el polvo en etanol al 50%/ H₂O al 50% a 100 mg/ml. Conservar a -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconstituya el polvo en H₂O a 1M y guárdelo a -20 °C.
Lisozima de huevo y gallina	Bioshop	LYS702.10	Reconstituir en H₂O a 50 mg/ml y almacenar a -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Solución salina tamponada con fosfato	Life technologies	20012-027	No se requiere solución salina tamponada con fosfato comercial, cualquier solución salina tamponada con fosfato estándar fabricada en laboratorio es suficiente.
Cloruro de sodio	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazol	Bioshop	IMD508.100
Guanidina-HCl	Sigma	G3272	La calidad debe ser superior al 98% de pureza.
0,5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Sulfato de níquel (II)	Bioshop	NIC700.500
Resina aglutinante	His EMD Millipore	69670-3	Almacenar en etanol al 20% 80% H₂O a 4 °C
Etanol anhidro	Alcoholes comerciales	P016EAAN	Diluir con agua según sea necesario.
Ácido acético glacial	Bioshop	ACE222.1
Acetato de sodio trihidrato	Bioshop	SAA305.500
Albúmina sérica bovina estándar	bio-rad	500-0206
Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada Fisher	scientific	BP120-500
Polietilenglicol 3350	Bioshop	PEG335.1
polietilenglicol 8000	Bioshop	PEG800.1
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Dodecil sulfato de sodio	Bioshop	SDS001