Regulación del crecimiento de células de Schwann in vitro mediante la técnica de campo eléctrico pulsado de nanosegundos

Resumen

Fuente: Han, J., et.al. Regulación del crecimiento de células de Schwann mediante un campo eléctrico pulsado de nanosegundos para la regeneración de nervios periféricos in vitro. J. Vis. Exp. (2024)

Este video demuestra la aplicación de la técnica de campo eléctrico pulsado de nanosegundos (nsPEF) para modular el crecimiento de células de Schwann (SC). Los pulsos eléctricos rápidos inducen nanoporos transitorios en las membranas SC, lo que facilita la entrada de calcio que activa las vías de señalización que impulsan la proliferación, la desdiferenciación y la secreción de factores neurotróficos de SC. Estas respuestas celulares mejoran el soporte axonal, la supervivencia neuronal y la mielinización potencial, destacando nsPEF como una herramienta prometedora para la reparación nerviosa.

Protocolo

1. Descongelación de células RSC96 criopreservadas

1. Descongelar el criovial que contiene 1 ml de suspensión celular agitándolo rápidamente en un baño de agua a 37 °C y luego agregarlo a un tubo de centrífuga que contenga 4-6 ml de medio de cultivo completo y mezclar bien.
2. Centrifugar a 1000 x g durante 3-5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 3 mL de medio de cultivo completo.
3. Añadir la suspensión celular a un matraz de cultivo (o placa) que contenga 6-8 ml de medio de cultivo completo e incubar a 37 °C durante la noche.
4. Al día siguiente, observe el crecimiento y la densidad celular bajo un microscopio.

2. Paso celular:

NOTA: Si la densidad celular alcanza el 80% -90%, está listo para el paso.

1. Deseche el medio de cultivo y enjuague las células 1-2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin iones de calcio y magnesio.
2. Añadir tripsina-0,53 mM EDTA al 0,25% (p/v) al matraz de cultivo (1-2 mL para un matraz T25, 2-3 mL para un matraz T75) e incubar a 37 °C durante 1-2 min.
3. Observe el desprendimiento celular bajo un microscopio. Si la mayoría de las células se vuelven redondas y se desprenden, devuelva rápidamente el matraz al área de trabajo, golpee suavemente el matraz y agregue 3-4 ml de medio de cultivo que contenga un 10% de FBS para detener la digestión.
4. Mezclar el contenido, aspirar la solución y centrifugar a 1000 x g durante 5 min. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células añadiendo 1-2 ml de medio de cultivo fresco y pipeteando suavemente.
5. Transfiera la suspensión celular a un nuevo matraz T25 en una proporción de 1:2 y agregue 7 ml de medio de cultivo.

3. Funcionamiento del dispositivo nsPEF

1. Vuelva a suspender las células RSC96 en 1 ml de medio de cultivo DMEM y transfiéralas a placas colorimétricas con electrodos en ambos lados.
2. Encienda el interruptor de encendido.
3. Ajuste los parámetros girando la perilla del instrumento para alterar la intensidad del campo eléctrico. Las intensidades establecidas en este estudio son 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm y 40 kV/cm.
4. Gire con cuidado los electrodos hasta que aparezcan chispas, permitiendo que las celdas reciban 5 pulsos de nsPEF de acuerdo con las intensidades de intensidad de campo preestablecidas antes de separar inmediatamente los dos electrodos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fuente de alimentación de alto voltaje para nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Pipeta	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
RSC96 Células Schwann	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
Scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
nsPEF	Times	M17/78-RG217

Cable especial para sistemas de microondas