Una inyección de vector viral en la médula espinal de ratas para el rastreo neuronal retrógrado

Resumen

Fuente: Keefe, K. M., et al. La inyección directa de un vector lentiviral resalta múltiples vías motoras en la médula espinal de la rata. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra la inyección de un vector viral de transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) en la médula espinal de ratas para rastrear las vías neuronales. El virus tiene glicoproteínas para la entrada sináptica y un gen codificador de proteínas fluorescentes. La aguja se inserta en la médula espinal y la suspensión del virus se administra a una velocidad controlada. La aguja finalmente se retira después de dejar suficiente tiempo para la difusión viral.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparaciones prequirúrgicas

1. Prepare agujas de vidrio extraídas para inyección viral unos días antes de la cirugía utilizando pipetas capilares de vidrio de 3,5 nanolitros diseñadas para inyectores de nanolitros. Tire de cada pipeta en un extractor de aguja de dos pasos de acuerdo con las instrucciones del fabricante para crear plantillas de dos agujas.
2. Refine la punta de las plantillas de agujas cortando aproximadamente 1-2 mm de exceso de vidrio con microtijeras. Mida el tamaño aproximado de la abertura bajo un microscopio con un portaobjetos de calibración de microscopio para aislar agujas con aberturas de 30-40 μm.
3. Con la aguja colocada a 30°, utilice una biseladora de micropipetas para crear una punta con una abertura de 30-40 μm y un ángulo biselado de 45°. Verifique el ancho de apertura usando la escala Vernier en la diapositiva de calibración. Pase agua y etanol a través de la aguja de vidrio con una jeringa con un accesorio de aguja flexible para eliminar los desechos y marque la aguja a intervalos regulares con un marcador negro.
4. Colocar las agujas en una placa de Petri tapada previamente limpiada con etanol al 70% y esterilizar durante 30 min en una campana de Bioseguridad bajo luz ultravioleta o UV.
5. Prepare lentivirus de transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) retirando un volumen adecuado del congelador inmediatamente antes del procedimiento.
   NOTA: Un volumen adecuado incluye la cantidad necesaria para la inyección (1 μL por inyección x número de inyecciones) más una pequeña cantidad de volumen adicional para tener en cuenta las pérdidas de pipeteo y carga. Transporte y almacene el virus en hielo cuando no esté en uso.
6. Prepare el inyector enchufándolo a la microbomba y colocándolo en un micromanipulador con una escala Vernier.
7. Para preparar la aguja de vidrio, cargue con cuidado un tinte de color como aceite rojo con una jeringa equipada con una aguja flexible. Asegúrese de que no queden burbujas en la aguja. Use una técnica aséptica al manipular la aguja y absténgase de tocar la punta.
8. Inserte la aguja de vidrio en el inyector, asegurándose de que la aguja esté asentada correctamente en las arandelas, la tapa del inyector esté bien atornillada y la aguja del inyector de acero se extienda aproximadamente 3/4 de la longitud de la aguja de vidrio. Los virus se pueden cargar en la aguja en un paso posterior.

2. Anestesia y preparación del sitio quirúrgico

1. Pesar al animal en una báscula digital. Registre el peso preoperatorio para determinar el volumen de anestesia requerido y permitir el control del peso después de la cirugía. En este protocolo se utilizaron ratas Sprague-Dawley hembras, de aproximadamente 200-250 g.
2. Anestesiar a la rata mediante inhalación de isoflurano o una solución inyectable de ketamina/xilacina (k/x). Aquí, la ketamina se inyecta por vía intraperitoneal a una dosis de 67 mg / kg y la xilacina a una dosis de 6,7 mg / kg.
3. Confirme un plano anestésico apropiado pellizcando el pie con firmeza. Si se produce una retirada reflexiva, espere varios minutos más antes de continuar.
   NOTA: Observe también los bigotes, los ojos y la frecuencia respiratoria en busca de signos de conciencia. Si los bigotes se contraen, el ojo parpadea cuando se toca suavemente o la respiración es rápida y superficial, espere hasta que el plano anestésico sea más profundo para continuar con el protocolo. Además, controle estos signos durante la cirugía de laminectomía e inyección. Si el animal muestra un plano anestésico poco profundo, administre una inyección de refuerzo de ketamina solo igual a la mitad de la dosis original de k / x.
4. Afeitar a la rata a lo largo de la línea media dorsal desde las caderas hasta el ángulo inferior de las escápulas. Tire de la piel del animal para un afeitado más fácil y preciso.
5. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos.
6. Aplique un antiséptico en el área afeitada para esterilizar el sitio. Para el primer exfoliante, empape la gasa estéril con una solución de yodo al 5% y limpie todo el cabello y los residuos. Siga esto con un deslizamiento unidireccional con una gasa estéril empapada en etanol al 70% para que no se contacte ningún área dos veces. Use esta misma técnica alternando gasas empapadas en yodo y etanol dos veces más.

3. Preparación del campo quirúrgico y del instrumento

1. Prepare un conjunto de herramientas quirúrgicas esterilizadas en autoclave que incluyan un bisturí, rongeurs, pinzas de dientes de rata, tijeras de resorte, hemostáticos, pinzas curvas de punto medio y retractores o ganchos pesados desenvolviendo la envoltura estéril para crear un campo estéril.
2. Abra un paquete de guantes quirúrgicos estériles y coloque la envoltura estéril del guante sobre la mesa. Utilícelo como campo estéril adicional para las herramientas usadas para evitar la contaminación de la envoltura estéril.
3. Deje caer una hoja de bisturí # 10 en el campo estéril. Asegure la hoja a un mango con hemostáticos. Coloque solución salina estéril, sutura de catgut crómico 4.0 y materiales para controlar el sangrado, como un cauterizador, gasa estéril, aplicadores estériles con punta de algodón (para hemorragias musculares) o espuma de gel o cera ósea (para hemorragias óseas) en un lugar accesible.
4. Recupera al animal y colócalo sobre un paño estéril. Coloque una gasa debajo de la vejiga para recolectar orina. Apoye el área objetivo con una toalla enrollada debajo del abdomen. Si está disponible, coloque una almohadilla térmica quirúrgica debajo del paño estéril, especialmente para procedimientos más largos.
   NOTA: La esterilidad es importante durante la cirugía de supervivencia. Tenga a mano una botella de spray de etanol al 70% para mantener la esterilidad de las manos enguantadas, y use un esterilizador de perlas si la esterilidad del instrumento se ve comprometida o entre cirugías individuales.

4. Exponer la columna vertebral e identificar el sitio de laminectomía

1. Identifique el área donde se realizará una incisión en la piel presionando suavemente los dedos en la última costilla para ubicar la vértebra Lumber o L1. Usando esto como punto de referencia, haga una incisión en la piel de 3-4 cm con un bisturí quirúrgico # 10 que termine justo debajo de L1 para exponer el músculo. Mantenga la piel tensa extendiendo suavemente y presionando firmemente con la hoja del bisturí para asegurar una incisión limpia.
2. Cortar y esparcir la grasa superficial con fórceps y tijeras si es necesario. (Dependiendo de la vértebra objetivo, puede haber o no una gran almohadilla de grasa superficial al músculo).
3. Siente las apófisis espinosas con la parte plana de la hoja del bisturí o con un dedo. A menudo, el área de la línea media estará delineada por una "V" de fascia blanca a cada lado. Haga un pequeño corte rostral para dejar espacio para agarrarse firmemente a un proceso superior con pinzas de dientes de rata, luego haga dos cortes largos y profundos lo más cerca posible de los procesos. En el punto más profundo del corte, la superficie dorsal de las vértebras se puede sentir con la hoja del bisturí.
4. Mantenga los músculos laterales a un lado con retractores o ganchos con peso para mejorar la visibilidad. Limpie el músculo alrededor de los procesos con un bisturí, tijeras de resorte o rongeurs para determinar la forma de sus cabezas.
   NOTA: Recuerde que la médula espinal no se extiende a lo largo de toda la columna vertebral, ya que el tejido de la médula espinal deja de crecer antes en el desarrollo que el hueso. Esto significa que el nivel espinal objetivo puede estar debajo de una vértebra con un nombre diferente.
5. Localice los procesos torácicos o T11 y T12 y T13 adyacentes.
   NOTA: La ayuda para apuntar a los niveles vertebrales correctos se puede encontrar en un atlas de la médula espinal de rata y estudios previos que describen puntos de referencia en el ratón, que tiene una estructura vertebral muy similar6,33. Deje un proceso espinoso rostral, como T9, intacto para dar un punto de referencia en la línea media.

5. Realización de una laminectomía

1. Una vez identificada correctamente la zona diana, realizar laminectomías de las caras dorsales de T11-T13. Extienda suavemente las vértebras para revelar los ligamentos intervertebrales, que son buenos sitios para insertar rongeurs para la mordida inicial de hueso. Mantenga los rongeurs en una posición semicerrada para aumentar el control fino.
2. Eliminar las apófisis espinosas y la cara dorsal de las vértebras dando pequeños bocados con los rongeurs. Tenga cuidado de no dañar la médula espinal ni alterar la duramadre. Levante ligeramente con las pinzas de dientes de rata para ayudar a separar la médula espinal de las vértebras y disminuir la tendencia a golpear el tejido de la médula espinal.
3. Despeje el hueso de la línea media para que se pueda observar el vaso sanguíneo de la línea media. Deje una ventana que muestre claramente el tejido de la médula espinal y esté libre de escombros.
4. Toque suavemente la médula espinal con fórceps. Algunos animales pueden saltar reflexivamente incluso si su plano anestésico es profundo. Aplique unas gotas de un agente anestésico, como la lidocaína, directamente en la médula espinal para evitar que salte durante el procedimiento de inyección.
5. Asegure al animal en un soporte espinal sujetando las pinzas estabilizadoras a las apófisis espinosas rostral y caudal a la ventana de laminectomía. Levante el abdomen del animal usando el soporte espinal para anular el efecto de los movimientos respiratorios. Esto aumentará la estabilidad de la aguja y garantizará la profundidad adecuada de inyección.

6. Carga del virus y colocación del inyector

1. Cargue el virus en el inyector pipeteando aproximadamente 5 μL en un trozo de parafilm y colocando la aguja de modo que la punta quede dentro de la gota.
2. Utilice la microbomba para extraer hasta 4 μl de virus a una velocidad de 20-100 nL/s.
3. Configure el controlador para inyectar y liberar una pequeña cantidad de virus de la aguja para asegurarse de que la punta de la aguja no esté bloqueada. Limpie el exceso de virus con una toallita de laboratorio.
   NOTA: Se puede usar una jeringa Hamilton con una aguja de acero como alternativa a las pipetas de vidrio extraídas.
4. Coloque el micromanipulador de modo que la escala de Vernier sea visible y coloque la aguja en la línea media de la médula espinal.
   NOTA: La línea media a veces puede estar ubicada por un vaso sanguíneo grande que corre en la superficie anterior de la médula espinal. Sin embargo, esto puede variar en ratas individuales, y la orientación de la línea media debe confirmarse en comparación con un proceso espinoso intacto.
5. Dirija la aguja lateralmente 0,8 mm utilizando la escala Vernier en el micromanipulador.
6. Baje la aguja hasta la médula espinal hasta que esté sangrando, pero no perforando, la duramadre. Con un movimiento de torsión rápido, pinche la duramadre con la aguja hasta que se hunda a una profundidad de 1,5 mm.

7. Inyectar el virus en la médula espinal

1. Una vez que la aguja esté en su lugar, programe el inyector para inyectar a una velocidad de 400 nL / min. Confirme que el virus está ingresando a la médula espinal observando el progreso del frente del tinte. No debe haber fugas o abultamientos evidentes en el tejido de la médula espinal. Si se observa una fuga, esto a veces se puede aliviar reduciendo la velocidad de inyección a 200 nL / min.
2. Una vez finalizada la inyección, deje que la aguja descanse en la médula espinal durante 2 a 5 minutos (dependiendo del volumen inyectado) para facilitar la difusión del virus.
3. Retire lentamente la aguja y pase al siguiente sitio de inyección. Inyecte 1 μL de virus en cada uno de los 6 sitios espaciados uniformemente aproximadamente a 1 mm de distancia a lo largo del tejido espinal L1-L4. Se puede usar la misma aguja para cada inyección siempre que continúe funcionando correctamente.

8. Cierre de heridas y cuidados postoperatorios

1. Retire al animal del soporte espinal y saque los retractores o ganchos utilizados para extender el músculo lateral. Asegúrese de que la herida esté libre de escombros antes de cerrarla.
2. Sutura el músculo con una sutura de catgut crómico 4.0. Corte los hilos de sutura cerca del nudo para reducir la probabilidad de irritación interna de la piel.
3. Grapa la piel para cerrarla con clips de 9 mm. Para permitir una curación óptima, alinee los bordes de la piel antes de grapar.
4. Coloque al animal en una almohadilla de calentamiento por convección de agua y vigílelo hasta que se despierte.
5. Inyecte de 5 a 10 ml de solución salina estéril por vía subcutánea para reponer líquidos y un antibiótico como cefazolina para prevenir infecciones. Cuando el animal sea ambulatorio, colóquelo nuevamente en su jaula de origen y proporcione analgésicos iniciales. Controle a las ratas para detectar cualquier signo de dolor y angustia, y trátelas de acuerdo con el procedimiento aprobado por su comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) para aliviar el dolor.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#10 Hojas de bisturí	Roboz	RS-9801-10	Para usar con el bisturí.
Jeringas de 1 ml	Becton, Dickinson and Company	309659	Para inyección de anestésico IP, posibles inyecciones de refuerzo anestésico e inyecciones de antibióticos.
Jeringas de 10 ml	Becton, Dickinson and Company	309604	Para inyectar solución salina en el animal, después de la cirugía.
4.0 Sutura de catgut crómico	DemeTECH	NN374-16	Para volver a unir el músculo durante el cierre.
Biseladora de micropipetas 48000	World Precision Instruments	32416	Se utiliza para biselar las puntas de los tubos capilares de vidrio extraídos para formar agujas de vidrio funcionales.
Solución de yodo al 5%	Purdue Products L.P.	L01020-08	Para uso en esterilización del sitio quirúrgico.
Etanol al 70%	N/A	N/A	Para la esterilización de agujas de vidrio recién preparadas, modelos animales durante la preparación quirúrgica y manos de cirujano durante la cirugía, así como todos los demás mantenimientos menores de esterilidad.
Anestésico (solución de ketamina / xilacina)	Zoetis	240048	Para mantener al animal en el plano correcto de conciencia durante la cirugía.
Antibiótico (cefazolina)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Inyectarse por vía subcutánea para prevenir infecciones después de la cirugía.
Esterilizador de cuentas	CellPoint	5-1450	Para esterilizar con calor los instrumentos quirúrgicos.
ciencia fina	cera de hueso	19009-00	Para sellar el hueso en caso de sangrado óseo.
Herramientas de Cauterización	de Ciencias Finas	18010-00	Para sellar cualquier arteria o vena cortada durante la cirugía para prevenir la pérdida excesiva de sangre.
Báscula digital	Okaus	REV.005	Para pesar el animal durante la preparación quirúrgica.
Accesorio de aguja flexible	World Precision Instruments	MF34G-5	Para limpiar agujas de vidrio y cargar aceite rojo en agujas de vidrio.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Para sellar el hueso en caso de hemorragia ósea.
Tubos capilares de vidrio	World Precision Instruments	4878	Para agujas de vidrio extraídas - debe estar diseñado para inyectores de nanolitros.
Cortadoras de cabello	Oster	111038-060-000	Para limpiar el sitio quirúrgico de cabello.
Hemostáticos	Roboz	RS-7231	Para uso general en cirugía.
Kimwipes	Kimtech	34155	Para uso general en cirugía.
Pinzas curvas de punta media	Roboz	RS-5136	Para uso general en cirugía.
Micromanipulador con escala Vernier	Kanetec	N/A	Para una orientación precisa durante la cirugía.
Microtijeras	Roboz	RS-5621	Para cortar silbidos de vidrio de tubos capilares de vidrio recién extraídos.
Microscopio con luz y escala Vernier Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Se utiliza para visualizar y medir el biselado de tubos capilares de vidrio extraídos en agujas de vidrio funcionales.
Controlador de bomba MicroSyringe	World Precision Instruments	62403	Para controlar la velocidad de inyección.
Inyector de cabeza de bomba Nanoliter 2000	World Precision Instruments	500150	Para cargar e inyectar virus de manera controlada.
Extractor de agujas	Narishige	PC-100	Para calentar y separar tubos capilares de vidrio para formar agujas de vidrio.
Ungüento oftalámico	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	Para proteger los ojos del animal durante la cirugía.
Parafilm	Bemis	PM-996	Para ayudar a cargar el virus en el nanoinyector.
Agujas PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Para usar con las jeringas de 1mL y 10 mL para permitir la inyección del modelo animal.
Pinzas de dientes de rata	Roboz	RS-5152	Para agarrar procesos espinosos.
Aceite rojo	N/A	N/A	Para proporcionar un frente para la visualización del virus que ingresa al tejido durante la inyección.
Retractores	Roboz	RS-6510	Para mantener abierta la herida quirúrgica.
Rimadyl Comprimidos	Bio Serv	MP275-050	Para el manejo del dolor postoperatorio.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Para extirpar músculo de la columna vertebral durante la cirugía.
Mango de hoja de bisturí	Roboz	RS-9843	Para cortar la piel abierta y la almohadilla de grasa de un modelo animal durante la cirugía.
Tijeras	Roboz	RS-5980	Para uso general en cirugía.
Clips de acero inoxidable para heridas	CellPoint	201-1000	Para atar la piel de la herida quirúrgica durante el cierre.
Pinzas para quitar grapas	Kent Scientific	INS750347	Para quitar las grapas, en caso de que se apliquen incorrectamente.
Paño estéril	Phenix Research Products	BP-989	Para proporcionar una superficie estéril para la operación.
Aplicadores estériles con punta de algodón	Puritan	806-WC	Para absorber la sangre en la herida quirúrgica mientras se mantiene la esterilidad.
Gasa estéril	Covidien	2146	Para limpiar el área quirúrgica y las herramientas quirúrgicas manteniendo la esterilidad.
Solución salina estéril	Baxter Healthcare Corporation	281324	Para uso en la limpieza de sangre y para reemplazar líquidos después de la cirugía.
Guantes quirúrgicos	N/A	N/A	Para uso del cirujano para mantener el campo estéril durante la cirugía.
Almohadilla térmica quirúrgica	N/A	N/A	Para mantener la temperatura corporal del modelo animal durante la cirugía.
Microscopio quirúrgico	N/A	N/A	Para una mejor visualización de la herida quirúrgica.
Grapadora quirúrgica	Kent Scientific	INS750546	Para aplicar las grapas.
Bomba de agua de terapia de calor T / Pump	Gaymar	TP500C	Para bombear agua caliente en la almohadilla de calentamiento por convección de agua.
Almohadilla de calentamiento por convección de agua	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Para uso en el área de recuperación postoperatoria para mantener la temperatura corporal del animal inconsciente.
Ganchos con peso	N/A	N/A	Para mantener abierta la herida quirúrgica.

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